RNA interferencia

Autor:
Publikované dňa:

Citácia: SOÓS, Andrej – PANČÍK, Peter. 2016. Biopedia.sk: RNA interferencia. [cit. 2024-03-19]. Dostupné na internete: <https://biopedia.sk/molekularna-biologia/rna-interferencia>.

Regulačné RNA molekuly link

Ako už bolo opísané v kapitole "regulácia génovej expresie", na regulácii génovej expresie sa podieľajú regulačné molekuly proteínového charakteru. Avšak, existuje mnoho molekúl RNA, ktoré nekódujú nijaký proteín, a preto sa aj nazývajú nekódujúce RNA (angl. noncoding RNAs). Medzi tieto patria aj tRNA a rRNA.

Pred pár rokmi sa ešte hovorilo o tzv. odpadovej DNA, lepšie známej z anglického originálu junk DNA. Množstvo tejto DNA malo predstavovať cca 90 % ľudského genómu. Časom sa však zistilo, že veľká časť genómu (a aj tejto "junk DNA") je transkribovaná, výsledkom čoho sú regulačné RNA. Takéto regulačné RNA sa nachádzajú aj u baktérií.

Prokaryotické regulačné RNA link

Prvým typom regulácie expresie u baktérií pomocou RNA je regulácia pomocou tzv. antisense RNA. Ide o RNA molekulu komplementárnu k danej mRNA, ktorú reguluje. Princípom je väzba na Shine-Dalgarnovu sekvenciu, ktorá predstavuje ribozomálnu väzbovú oblasť (angl. ribosome-binding site, RBS). Táto sekvencia je dôležitá u baktérií pre väzbu 30S podjednotky a teda i začatie translácie. Antisense RNA sa komplementárne viažu k regulovanej mRNA, a tak zabraňuje vzniku translačného komplexu.

Translácia mRNA môže byť aj autoregulovaná. Príkladom sú tzv. termosenzory. Z PCR vieme, že pri zvýšenej teplote majú molekuly RNA tendenciu denaturovať. RNA molekuly, a teda aj mRNA, nie sú lineárne molekuly, ale majú svoju sekundárnu a terciárnu štruktúru. Za normálnej teploty môže byť v mRNA prítomná vlásenka (angl. hairpin), ktorá v sebe zahŕňa aj RBS, a teda sa nevytvára translačný komplex. Za zvýšenej teploty sa tieto vlásenky môžu "rozpliesť" a RBS sa sprístupní. Príkladom je pozitívna regulácia translácie virulentných génov u baktérií Listeria monocytogenes.

Ďalším typom regulácie translácie sú tzv. ribospínače (angl. riboswitches). Princípom je, znovu, vytváranie sekundárnej štruktúry. Jedným z mechanizmov, ako tieto molekuly regulujú génovú expresiu, je represia translácie. Malé molekuly (napr. molekula vitamínu B1) sú schopné viazať sa na príslušnú mRNA, a tak signalizovať, že enzýmy potrebné na syntézu produktu (tohto vitamínu) nie je potrebné syntetizovať. Väzbou sa zabráni translácii.

Eukaryotické regulačné RNA link

Eukaryoty obsahujú vo svojom genóme veľké množstvo génov kódujúcich nekódujúce RNA molekuly. Najznámejšími sú tzv. microRNA, označované ako miRNA, alebo siRNA (angl. small/short interfering RNA). Tieto patria medzi molekuly RNA s kratšou dĺžkou. Dlhšie nekódujúce RNA molekuly sa označujú ako lncRNA (angl. long noncoding RNAs), tie sú dlhšie ako 200 nt.

RNA interferencia link

MicroRNA sú molekuly dlhé cca 22 nukleotidov (nt) a ich gény sa nachádzajú napríklad v intrónoch. MiRNA gény sú prepisované ako dlhšie jednovláknové RNA s vlásenkovitou štruktúrou. Sú prepisované pomocou RNA polymerázy II, poprípade III. V prípade transkripcie pomocou RNA polymerázy II obsahujú tieto prekurzory zvané pri-miRNA na 5´ konci cap (čiapočku) a na 3´ konci polyadenylátový chvostík (pridaný pomocou polyadenylát polymerázy). Tento transkript je najprv upravovaný pomocou nukleázového komplexu Drosha/DGCR8. DGCR8 sa často nazýva aj Pasha. Vzniká pre-miRNA, ktorá je transportovaná cez jadrové póry do cytoplazmy pomocou transportných proteínov (Exportin 5). Po transporte je pri-miRNA, stále jednovláknová vlásenka, upravená pomocou nukleázy Dicer na dvojvláknovú RNA. Vzniká duplex miRNA, z ktorého sa vyberie jedno vlákno a stane sa súčasťou komplexu RISC (RNA-induced silencing complex). Komplex miRISC je potom schopný viazať sa na mRNA (na 3´ neprekladanú oblasť, tzv. 3´ UTR).

Tu môžu nastať dva základné procesy:

  1. Cieľová mRNA je priamo poštiepená pomocou RISC-u (toto sa deje, ak je miRNA perfektne komplementárna k cieľovej mRNA). Tento proces je oveľa častejší u rastlín ako u živočíchov. Veľmi významnou súčasťou RISC-u je proteín Argonaute.
  2. Druhý spôsob predstavuje väzbu miRISC na cieľovú mRNA (nedokonalá komplementarita, medzi miRNA-mRNA sa nachádzajú nespárované bázy) a blokovanie translácie rôznymi mechanizmami. V tomto prípade môže byť táto mRNA napr. transportovaná do P-teliesok (P = procesing), v ktorých sa nachádzajú nukleázy a cieľovu mRNA poštiepia. Proces blokovania translácie je častejší u zvierat (vrátane človeka) ako u rastlín.

Molekuly miRNA regulujú viac ako tretinu ľudských génov. Veľmi zaujímavá je ich funkia onkogénov alebo tumorsupresorových génov. Regulujú totiž aj expresiu mnohých génov podporujúcich delenie bunky. Môžu sa tiež podieľať na protivírusovej obrane organizmu.

Iným typom regulačných RNA sú tzv. piRNA (Piwi-interacting RNA, z angl. P-element-induced wimpy testis). Tie sú veľmi dôležité na reguláciu mobilných elementov (transpozónov, „skákavých génov“, tj génov, ktoré môžu meniť svoje miesto v genóme a zároveň sa aj duplikovať). piRNA majú veľký význam v pohlavných bunkách, aby transpozóny svojím „skákaním“ nespôsobovali problémy (napr. inzerčnú inaktiváciu atď.). Fungujú na veľmi podobnom princípe ako miRNA.

Transpozóny, aj keď boli považované za zbytočnosť, majú veľký význam. Napríklad u baktérií transpozón lokalizovaný na chromozóme môže „skočiť“ na plazmid, v recipientnej bunke sa replikovať a recipientná baktéria dostane napr. gén rezistencie na antibiotikum. U cicavcov pochádza z transpozónu napríklad proteín zúčastňujúci sa tvorby protilátok.

RNA interferencia sa využíva aj v génovom inžinierstve. Týmto spôsobom je možné vykonať tzv. knock-down, čiže nie úplné vyradenie génu z funkcie, len zníženie jeho expresie.

Ďalšie články

Regulácia génovej expresie

Najčastejšie je termín génová expresia spojený s vyjadrením aktivity génu, čo možno voľne preložiť ako frekvenciu, resp. mieru, s akou (a či vôbec) dochádza k transkripcii génu a vzniku funkčného proteínu. Prakticky každý krok, ktorý vedie od transkripcie až po vznik hotového proteínu, je nejakým spôsobom regulovateľný (sila promótoru, posttranskripčné úpravy, transport cez jadrovú membránu, efektivita translácie, posttranslačné úpravy). U eukaryot je významným regulačným mechanizmom aj miera kondenzácie chromatínu.

Izolácia nukleových kyselín

Izolácia nukleových kyselín predstavuje získanie DNA alebo RNA o dostatočnej čistoty (bez prímesí, tzv. kontaminantov) a kvality (nedegradovaná, nefragmentovaná). Z ohľadom na zdroj (rastlinný, živočíšny materiál, špeciálne zdroje - pôda) je aj výber techniky izolácie odlišný. Rozdiel je aj v izolácii DNA a RNA, a špeciálne mRNA.

Klonovanie DNA

Klonovaním DNA sa rozumie vytváranie množstva kópií definovanej molekuly DNA prostredníctvom techník rekombinantnej DNA. Potrebné sú k tomu špeciálne enzýmy - restrikčné endonukleázy a ligáza - a klonovací vektor, ktorým je spravidla špeciálne navrhnutý plazmid s miestom pre inzerciu fragmentu DNA, ktorý chceme klonovať, a génom pre antibiotikovú rezistenciu. Následne sa týmto vektorom transformuje živá bakteriálna bunka a jej klony sa nechajú rásť na selektívnych médiách s antibiotikom.

forward