Molekulárna biológia

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Úvod do molekulárnej biológie

Molekulárna biológia sa vyprofilovala ako nová vedná disciplína v druhej polovici 20. storočia objavom štruktúry DNA v roku 1953 Watsonom a Crickom. Dovtedy bola súčasťou biochémie, príp. genetiky. Jej predmetom výskumu je práve DNA - hmotná podstata dedičnosti.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Organizácia DNA

DNA tvorí genetickú organizáciu väčšiny organizmov. V prokaryotickej bunke nie je genetická informácia oddelená od zvyšku cytoplazmy jadrovou membránou. Oblasť, v ktorej sa DNA nachádza, sa označuje ako nepravé jadro alebo nukleoid. Jadrová DNA eukaryot na rozdiel od prokaryotického chromozómu je oddelená od metabolických procesov prebiehajúcich v cytoplazme dvojitou jadrovou membránou. Okrem toho eukaryoty majú aj mimojadrovú DNA v podobe mitochondriálnej, a rastliny aj chloroplastovej DNA.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Replikácia DNA

Objav štruktúry DNA v roku 1953 Watsonom a Crickom ponúkol jednoduché riešenie, ako môže dochádzať k replikácii DNA. Princípom tohto tzv. semikonzervatívneho modelu replikácie je, že dochádza k rozpletaniu dvojzávitnice DNA, pričom obidva jednovláknové reťazce DNA tvoria vzor - matricu pre syntézu nového protiľahlého reťazca. Celý proces prebieha za spoluúčasti mnohých enzýmov, z ktorých najdôležitejší je DNA-polymeráza. Replikácia eukaryotickej DNA sa v princípe od prokaryotickej replikácie neodlišuje, problém však nastáva pri replikácii koncových úsekov chromozómov - telomér.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Transkripcia

Transkripcia predstavuje prepis genetickej informácie z jedného typu nukleovej kyseliny do druhého typu. Štandardne sa tým myslí prepis informácie z DNA do RNA pomocou enzýmu RNA polymerázy, hoci pomocou špeciálneho enzýmu - reverznej transkriptázy - je možný aj opačný smer. Transkripcia prebieha v niekoľkých fázach.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Translácia

Translácia predstavuje konečný proces realizácie genetickej informácie štruktúrnych génov. Prebieha na ribozómoch v cytoplazme alebo membránach endoplazmatického retikula za účasti transferových RNA (tRNA), ktoré do ribozómov prinášajú jednotlivé aminokyseliny. Na ribozómoch, ktoré sú akýmisi miniatúrnymi továrňami na výrobu bielkovín, prebieha polymerizácia aminokyselín do súvislého polypeptidového reťazca na základe genetického kódu.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Regulácia génovej expresie

Najčastejšie je termín génová expresia spojený s vyjadrením aktivity génu, čo možno voľne preložiť ako frekvenciu, resp. mieru, s akou (a či vôbec) dochádza k transkripcii génu a vzniku funkčného proteínu. Prakticky každý krok, ktorý vedie od transkripcie až po vznik hotového proteínu, je nejakým spôsobom regulovateľný (sila promótoru, posttranskripčné úpravy, transport cez jadrovú membránu, efektivita translácie, posttranslačné úpravy). U eukaryot je významným regulačným mechanizmom aj miera kondenzácie chromatínu.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

RNA interferencia

Na regulácii génovej expresie sa podieľajú regulačné molekuly proteínového charakteru ale aj molekuly RNA. Najznámejším typom takýchto molekúl sú tzv. antisense RNA, ktoré sú komplementárne k špeciálnym sekvenciám na mRNA. Ich väzba s mRNA značí signál pre degradáciu takéhoto komplexu, čo je princípom negatívnej regulácie. Okrem toho existujú aj iné typy interferencie - termosenzory, ribospínače, a u eukaryot aj tzv. microRNA, lncRNA a iné.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Izolácia nukleových kyselín

Izolácia nukleových kyselín predstavuje získanie DNA alebo RNA o dostatočnej čistoty (bez prímesí, tzv. kontaminantov) a kvality (nedegradovaná, nefragmentovaná). Z ohľadom na zdroj (rastlinný, živočíšny materiál, špeciálne zdroje - pôda) je aj výber techniky izolácie odlišný. Rozdiel je aj v izolácii DNA a RNA, a špeciálne mRNA.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Klonovanie DNA

Klonovaním DNA sa rozumie vytváranie množstva kópií definovanej molekuly DNA prostredníctvom techník rekombinantnej DNA. Potrebné sú k tomu špeciálne enzýmy - restrikčné endonukleázy a ligáza - a klonovací vektor, ktorým je spravidla špeciálne navrhnutý plazmid s miestom pre inzerciu fragmentu DNA, ktorý chceme klonovať, a génom pre antibiotikovú rezistenciu. Následne sa týmto vektorom transformuje živá bakteriálna bunka a jej klony sa nechajú rásť na selektívnych médiách s antibiotikom.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Vektory v molekulárnej biológii

Vektorom v molekulárnej biológii sa rozumie molekula DNA, ktorá dokáže prijať cudzí úsek DNA a replikovať sa v živom organizme. Cudzím úsekom (inzertom) je najčastejšie gén alebo jeho časť, ktorú študujeme. Môže ním byť najčastejšie PCR produkt s čítacím rámcom pre proteín, ktorý chceme v organizme produkovať. Takýto vektor sa nazýva expresný vektor. V závislosti od účelu použitia inzertu alebo organizmu, v ktorom sa vektorová molekula dokáže ujať a množiť, rozlišujeme viacero typov vektorov.

20.12.2016 pred 10 mesiacov

Elektroforéza nukleových kyselín

Separácia nukleových kyselín, najčastejšie len na základe ich veľkosti, prebieha najčastejšie v agarózovom alebo polyakrylamidovom géli rôznej hustoty s využitím rôznych elektroforetických roztokov. Veľkosť jednotlivých separovaných fragmentov DNA alebo RNA je možné odhadnúť pomocou tzv. štandardu molekulových hmotností. Nukleové kyseliny sa po elektroforetickej separácii vizualizujú pomocou fluorescenčných látok, napr. etídiumbromidu.

21.12.2016 pred 10 mesiacov

Hybridizácia nukleových kyselín

Edwin Chargaff v roku 1952 zistil, že množstvo adenínu v DNA je rovné množstvu tymínu, a taktiež množstvo cytozínu je rovné množstvu guanínu. Neskôr sa zistilo, že je tomu tak práve preto, že molekula DNA tvorí dvojvlákno, kde A sa páruje s T a C sa páruje s G. Na základe tohto pravidla komplementarity je možné párovať - hybridizovať vlákno o známej sekvencii k neznámej vzorke DNA. Pomocou rôzneho značenia je možné identifikovať úseky DNA, vylúčiť muža z otcovstva alebo usvedčiť páchateľa zločinu.

24.12.2016 pred 10 mesiacov

Polymerázová reťazová reakcia - PCR

Polymerázová reťazová reakcia, ako už názov napovedá, je technika molekulárnej biológie spočívajúca v opakujúcej sa polymerizácii DNA. Podstatou PCR je namnoženie špecifického úseku DNA pomocou termostabilnej DNA-polymerázy, voľných deoxyribonukleotidov a tzv. primerov, čo sú krátke jednovláknové oligonukleotidy komplementárne k templátovej DNA, určujúce začiatok a koniec PCR produktu. PCR je súčasťou mnohých diagnostických (napr. identifikácia DNA polymorfizmov) a preparatívnych techník (napr. namnoženie DNA za účelom klonovania) ako aj súčasťou moderného sekvenovania.

24.12.2016 pred 10 mesiacov

Kvantitatívna PCR (real-time PCR)

Kvantitatívna PCR je variáciou klasickej PCR s tým rozdielom, že do zmesi sú pridané farbivá, ktoré pomocou špeciálneho real-time prístroja dokážu určiť množstvo vstupnej DNA v zmesi. Toto meranie množstva DNA prebieha na konci každého cyklu polymerizácie, preto sa metóda označuje real-time (z angl. v reálnom čase). Metóda sa hodí predovšetkým na meranie neznámeho množstva DNA v zmesi rôznych DNA (napr. vírusovej DNA v izoláte od pacienta) alebo na meranie hladiny expresie génov (prostredníctvom reverzného prepisu mRNA do cDNA).

24.12.2016 pred 10 mesiacov

Sekvenovanie DNA

Sekvenovanie znamená určenie primárnej štruktúry DNA. Znalosť genetickej informácie je nevyhnutným predpokladom výskumu v mnohých oblastiach súčasnej biológie, pretože umožňuje porozumieť molekulárnej podstate biologických procesov. Medzi základné, a z časti už aj historické metódy sekvenovania patrí chemická metóda Maxama a Gilberta a enzýmová metóda Sangera.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Sekvenovanie novej generácie

Sekvenovaním novej generácie sa rozumejú zautomatizované metódy sekvenovania, ktoré využívajú modifikácie Sangerovho enzymatického sekvenovania alebo úplne nové metódy, napr. ligáciu DNA. Tieto metódy umožňujú sekvenovať veľké množstvo DNA vo viacerých paralelných behoch. Samotnému sekvenovaniu predchádza tvorba tzv. DNA knižnice, ktorá obsahuje nadrobno posekanú vzorku DNA zmesi. Detekcia sekvencie je rôzna v závislosti od použitej techniky.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Molekulárne motory

Molekulárne motory patria k najfascinujúcejším bielkovinám. Predstavujú drobné biologické "stroje", ktoré zabezpečujú pohyb v živých organizmoch na molekulárnej úrovni. Spoločnou črtou molekulárnych motorov a tých, ktoré poznáme z techniky, je premena jednej formy energie na mechanickú prácu. V prípade molekulárnych motorov je týmto "pohonom" najčastejšie opakované enzymatické štiepenie - hydrolýza - molekúl s makroergickými väzbami (napr. ATP) alebo protónový gradient.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Heterologická expresia proteínov

Techniky molekulárnej biológie nám umožňujú vniesť cudzí gén prakticky do ľubovolného organizmu. Pre účely štúdia alebo priemyselnej produkcie želanej látky (spravidla proteínu alebo peptidu - hormónu), nám často bakteriálne alebo kvasinkové kultúry slúžia ako ideálny živý systém. Tento postup sa vola heterologická expresia. Nie vždy je však jednoduché dosiahnuť optimálnu produkciu biologicky aktívneho proteínu. Aj keď sa mnohé dá predpokladať ešte pri návrhu systému, optimalizácii expresie sa spravidla nevyhneme.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Extrakcia proteínov

Tak ako proteíny tvoria rôznorodú skupinu molekúl, je aj prostredie bunky plné rôznych väčších či menších "neproteínových" molekúl. Extrakcia proteínov teda začína oddelením proteínov od zvyšku bunkového materiálu a ďalšej purifikácie proteínovej suspenzie. Iné podmienky je potrebné zachovať keď potrebujeme zachovať natívne vlastnosti študovaného proteínu. Dosiahneme to pridaním rôznych "ochranných" aditív.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Chromatografické separačné metódy - úvod

Pôvodný názov chromatografie vychádza z experimentov využívajúcich filtračný papier na separáciu rôznych farebných komponentov roztoku. Dnes sa všeobecne jedná o techniky separácie jednotlivých proteínov z roztoku na základe ich rôznej pohyblivosti v závislosti od ich veľkosti, náboja alebo hydrofobicity.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Separácia proteínov - gélová filtrácia

Gélová filtrácia umožňuje separáciu proteínov na základe ich veľkosti. Chromatografická kolóna je naplnená chemicky inertnými, polysacharidovými alebo polyakrylamidovými, pórovitými guličkami tvoriacimi gélovitú hmotu. Princíp separácie spočíva v tom, že menšie molekuly musia prekonať dlhšiu dráhu, pretože vchádzajú do pórov guľôčok, čo predlžuje ich čas, dokedy ostávajú v kolóne. Táto technika sa hodí aj na odsoľovanie proteínovej suspenzie.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Separácia proteínov - ionomeničová chromatografia

Ionomeničová chromatografia zabezpečuje separáciu proteínov na základe ich náboja. Z toho dôvodu je chromatografická matrica nabitá buď kladne (anex - lebo viaže anióny) alebo záporne (katex - lebo viaže katióny). Elúciu proteínov zabezpečuje zmena koncentrácie soli v roztoku, čo ovplyvňuje iónovú silu.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Separácia proteínov - chromatografia v reverznej fáze

Chromatografia v normálnej fáze spočíva v interakcii matrice s hydrofilnými povrchmi proteínov, pričom mobilnou fázou je nepolárne rozpúšťadlo (napr. chloroform). Chromatografia v reverznej fáze je presným opakom: matrica interaguje s hydrofóbnymi povrchmi proteínov a mobilnou fázou je najčastejšie metanol alebo acetonitril. Výhodou chromatografie v reverznej fáze je možnosť separácie širokého spektra molekúl, vrátane nabitých a polárnych molekúl, nevýhodou je denaturácia proteínov.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Separácia proteínov - hydrofóbna chromatografia

Princíp hydrofóbnej chromatografie (HIC) je podobný ako v prípade chromatografie v reverznej fáze (RPC), pretože využíva separáciu proteínov na základe hydrofobicity. Základným rozdielom je, že pri HIC nepracujeme s tak veľmi hydrofóbnym nosičom ako pri RPC, takže dokážeme eluovať proteíny pomocou zmeny zloženia alebo koncentrácie soli v mobilnej fáze, zmenou pH alebo teploty, čím sú zachované jeho biologické vlastnosti.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Separácia proteínov - afinitná chromatografia

Princípom afinitnej chromatografie je špecifická väzba určitého štruktúrneho proteínového motívu so špecifickým ligandom, kovalentne naviazaným na matricu. Je to teda princíp väzby protilátok s antigénom - "kľúč a zámok". Proteíny bez tohto motívu sa za ideálnych podmienok na matricu neviažu, takže selektivita a vysoká rozlišovacia schopnosť, ako aj kapacita kolóny, sú pri tejto separačnej technike veľmi vysoké.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC)

HPLC nie je ani tak samostatná chromatografická metóda, ako zdokonalenie chromatografických techník za účelom efektívnejšej a rýchlejšej separácie analytov. Výhodou je predovšetkým úspora času. V ostatných desaťročiach je hojne používaná na analytickú separáciu peptidov a proteínov, ich kvantifikáciu a charakterizáciu. Väčšie kolóny majú využitie aj pri preparatívnej separácii.

25.12.2016 pred 10 mesiacov

Denaturačná elektroforéza proteínov v polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE)

Elektroforetická separácia proteínov v najjednoduchšej forme prebieha vo vertikálnej elektroforetickej aparatúre v prostredí polyakrylamidového gélu (PAGE) a za prítomnosti silného detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS). Vlastnosťou SDS je pokrytie celého povrchu proteínov záporným nábojom, takže separácia proteínov prebieha bez ohľadu na ich prirodzený náboj alebo terciárnu štruktúru - t.j. len na základe ich veľkosti, resp. hmotnosti.