CRISPR-Cas9

Autor: ANDREJ SOÓS

 

CRISPR – clustered regularly interspaced short palindromic repeats
Cas – CRISPR-associated
PAM – protospacer-adjacent motif
crRNA – CRISPR RNA
tracrRNAtrans-acting CRISPR RNA
gRNA – guide RNA
sgRNA – single-guide RNA
HR – homologická rekombinácia
NHEJ – spojenie nehomologických koncov (z angl. nonhomologous end-joining)
GFP – zelený fluorescenčný proteín (z angl. green fluorescent protein)

CRISPR-Cas je primitívny imunitný systém prokaryotov. Prakticky po napadnutí baktérie fágom tzv. Cas proteíny dokážu naštiepiť fágovú DNA a jej časť integrovať do tzv. CRISPR regiónu v bakteriálnom genóme. CRISPR región sa skladá z častí fágovej DNA od rôznych fágov a celkovo fragmentov cudzorodej DNA (tzv. protospacery) oddelenými tzv. CRISPR repetíciami. Po napadnutí bunky fágom tento región exprimovať za vzniku polycistronickej RNA (tzv. prekurzorovej CRISPR RNA), ktorá je potom naštiepená na menšie fragmenty. Exprimovaním CRISPR lokusu a procesovaním dlhého transkripciu tohto lokusu na kratšie transkripty je možné rozpoznať [funkcia crRNA (eventuálne v spojení s ďalšou in vivo, tzv. tracrRNA)] a pomocou konkrétneho typu Cas proteínu degradovať1.

Cas9 proteín má endonukleázovú aktivitu. Dokáže vytvárať dvojvláknové zlomy. CRISPR-Cas vyžaduje tri zložky: Cas proteín, tracrRNA a crRNA. V tomto komplexe sa na základe párovania báz nájde cieľová DNA a Cas proteín ju rozštiepi.

V génovom inžinierstve možno využiť schopnosť Cas proteínu (využíva sa Cas9) tvoriť dvojvláknové zlomy (DSB – double-strand breaks). Tie môžu byť opravené jednak pomocou homologickej rekombinácie (HR – presná oprava, vyžaduje však homológiu v danej oblasti), alebo pomocou NHEJ (nonhomologous end-joining) – oprave, pri ktorej typicky vznikajú indely. Je teda možnosť v géne vytvoriť indel a tým ho inaktivovať, alebo nahradiť iným (vloženým úsekom s homologickými oblasťami, ktorý sa môže do genómu integrovať pomocou HR).2

V génovom inžinierstve je možné tento systém využiť na indely alebo vloženie exogénnej DNA do genómu. V prvom prípade sa vytvorí dvojvláknový zlom3 a pomocou NHEJ sa zlom spojí. To máva typicky za následky indely. V druhom prípade po vytvorení zlomu nastupuje homologická rekombinácia a gén sa vloží do genómu. Avšak, mimo klasického Cas9 boli vytvorené rôzne varianty4 – napr. dCas95, na ktorý možno „zavesiť“ napr. GFP a pomocou sgRNA (umelo vytvorená; vlásenkovitá štruktúra vytvorená po transkripcii z vektora)6 lokalizovať konkrétne sekvencie na chromozóme a vizualizovať ich v mikroskope. Inou možnosťou je modifikácia Cas proteínu, a to taká, že môžeme zrušiť aktivitu jednej domény – buď tej, ktorá priamo viaže DNA vlákno prostredníctvom sgRNA, alebo tej, ktorá sa s vláknom DNA nepáruje. Dokonca je dnes už možné editovať DNA na úrovni konkrétneho nukleotidu. Možná je aj fúzia dCas proteínu s doménou aktivujúcou/reprimujúcou transkripciu a sledovať tak funkciu regulačnej sekvencie DNA, eventuálne pomocou aktivačných/represorových domén cielene regulovať transkripciu. Možností je veľa.

Po napadnutí fágom je fágová DNA rozpoznávaná Cas proteínmi, ktoré ju naštiepia na menšie fragmenty a integrujú do CRISPR lokusu. Pre jednoduchosť je uvedená len jedna časť cudzorodej DNA, v skutočnosti sú však tieto fragmenty oddelené CRISPR repetíciami. Pri ďalšom napadnutí fágom nastane expresia CRISPR regiónu a vytvorí sa polycistronická RNA – prekurzorová crRNA. Tá je naštiepená na malé zrelé crRNA a tie tvoria komplex s tracrRNA a Cas9 proteínom. Podľa komplementarity sa rozpozná cudzorodá DNA a je komplexom CRISPR-Cas9 degradovaná. Pozn. pre jednoduchosť je v obrázku komplex crRNA-tracrRNA uvedený ako gRNA.


1K štiepeniu je nutná sekvencia PAM
2CRISPR-Cas systémom je možná editácia genómu nielen u prokaryot, ale i u eukaryot
3DSB – double-strand break
4napríklad formy Cas proteínu štiepiace len jedno vlákno
5defektný Cas9 – nemá endonukleázovú aktivitu
6konkrétne hybrid crRNA a tracrRNA