Chromatografické separačné metódy - úvod

Pôvodný názov chromatografie vychádza z experimentov využívajúcich filtračný papier na separáciu rôznych farebných komponentov roztoku (lat. chroma = farba). Dnes sa všeobecne jedná o techniky separácie jednotlivých proteínov z roztoku na základe ich rôznej pohyblivosti v závislosti od ich veľkosti, náboja alebo hydrofobicity.

Všeobecnými cieľmi separácie proteínov sú:

  • analytická separácia - za účelom presného rozdelenia a identifikácie jednotlivých zložiek komplexnej proteínovej zmesi
  • preparatívna separácia - za účelom purifikácie konkrétneho proteínu vo väčšom množstve a vysokej čistote

Samotná časť aparatúry, v ktorej dochádza k chromatografickej separácii proteínov, sa nazýva chromatografická kolóna, skrátene len kolóna. Kolóna je naplnená nosičom - matricou rôzneho zloženia. Vlastnosti väčšiny matríc určuje charakteristická skupina (hydrofóbna molekula alebo molekula s kladným alebo záporným nábojom), ktorá sa nazýva ligand. Matricu, resp. kolónu, treba pred každým použitím ekvilibrovať tlmivým roztokom s požadovanými chemickými vlastnosťami. Následne sa na jednu stranu kolóny nanáša roztok so zmesou proteínov (niekedy sa nazýva analyt), pričom z druhej strany postupne odchádzajú separované frakcie proteínov. Proces vytesňovania proteínov z matrice sa nazýva elúcia a proteínové frakcie sú jednotlivé eluáty. Niektoré techniky dokážu automaticky kvantifikovať množstvo eluovaného proteínu v čase a prevádzajú ho do grafickej podoby, ktorá sa nazýva chromatogram.

Dôležitým parametrom každej chromatografickej metódy, ako aj samotnej kolóny, je jej rozlišovacia schopnosť, ktorá určuje, s akou jemnosťou a presnosťou vieme rozlíšiť dva veľmi podobné proteíny. Závisí od viacerých faktorov, napr. aj od času separácie.

Pri nedostatočne dlhom čase separácie je možné, že niektoré podobné proteíny budú eluované súčasne do jednej frakcie (obr., červený štvorec). Dlhší čas separácie umožní jemnejšie rozlíšenie medzi tými proteínmi. Podobne, niektoré proteíny sme schopní identifikovať ako samostatné jednotky, len ak separácia prebieha pomalšie (obr., červený krúžok).

Množstvo proteínu sa často uvádza ako miera absorbancie pri vlnovej dĺžke 280 nm (A280). Prístrojové, spektrofotometrické meranie absorbancie je jedným z možných spôsobov merania koncentrácie mnohých látok (proteínov, nukleových kyselín a pod.).
Tab. Najbežnejšie chromatografické metódy na separáciu proteínov
metódaskratkaseparácia
podľa
tlak
gélová filtráciaSECveľkosťnízky
ionomeničová chromatografiaIEXnábojnízky
chromatografia v reverznej fázeRPChydrofobicitanízky
hydrofóbna chromatografiaHIChydrofobicitanízky
afinitná chromatografiaACligand-ligandnízky
vysokoúčinná kvapalinová chromatografiaHPLC(rôzne z vyššie uvedených)vysoký

Použitá literatúra

Pri písaní článkov o separácii proteínov pomocou uvedených techník som vychádzal predovšetkým z tejto literatúry:

  1. Pančík P.: M3 proteín Myšieho herpetického vírusu, nový modulátor imunitnej odpovede. (2013). Virologický ústav Slovenskej akadémie vied, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava. Dizertačná práca.
  2. Grones J.: Purifikácia proteínov. Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava.
  3. Roe B.A.: Introductory Biochemistry Lecture Notes - Lecture 12: Protein Purification. (2006). Stephenson Research and Technology Center, The University of Oklahoma
  4. Protein Purification Handbook. Principles and Methods. (2001). Amersham Biosciences
  5. Koenen R.: Heterologous expression and purification of protein in E. coli. Institut für molekulare Herz-Kreislaufforschung, University Hospital of the RWTH, Aachen
  6. Introduction to Protein Techniques. (2012). The Protein Facility, Iowa State University of Biotechnology
  7. Berg J.M. et al.: Biochemistry. (2006). W.H. Freeman. pp. 1026. ISBN-13: 978-0716787242
  8. Tosoh Bioscience LLC: The Chemistry of Innovation
  9. Proteinchemist.com
  10. Karlström, A.E.: Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC), Reversed-Phase Chromatography (RPC). Royal Institute of Technology, AlbaNova University Center, Dept. of Biotechnology, Stockholm
  11. Magdeldin S. a Moser A.: Affinity Chromatography: Principles and Applications. (2012). Affinity Chromatography, Dr. Sameh Magdeldin (Ed.), pp. 368. ISBN: 978-953-51-0325-7. InTech
  12. Abi-Ghanem D.A. a Berghman L.R.: Immunoaffinity Chromatography: A Review. (2012). Affinity Chromatography, Dr. Sameh Magdeldin (Ed.), pp. 368. ISBN: 978-953-51-0325-7. InTech
  13. Methods in Molecular Biology, vol. 251, HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols. (2004). Marie-Isabel Aguilar (Ed.), pp. 411. ISBN: 978-089-60-3977-3. Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.
  14. HPLC Basics: Fundamentals of Liquid Chromatography (HPLC). Agilent Technologies, Inc.
  15. Hedhammar M. et al.: Chromatographic methods for protein purification. Royal Institute of Technology, AlbaNova University Center, Dept. of Biotechnology, Stockholm