Separácia proteínov - gélová filtrácia

Táto technika využíva separáciu proteínov na základe veľkosti molekúl (angl. size exclusion chromatography, SEC). Chromatografická kolóna je naplnená chemicky inertnými, polysacharidovými alebo polyakrylamidovými, pórovitými guličkami (matricou), tvoriacimi gélovitú hmotu. Kolóna je zaliata tlmivým roztokom, ktorý vypĺňa póry ako aj celý priestor medzi guličkami. Časť roztoku, ktorá vypĺňa póry, sa niekedy nazýva stacionárna fáza, zatiaľ čo roztok medzi guličkami sa nazýva mobilná fáza. Mobilná fáza zaberá približne 30% celkového objemu rozpúšťadla v kolóne. Pohyb mobilnej fázy je spôsobený gravitáciou, ale môže byť zrýchlený pomocou tlakovej pumpy.

Princípom separácie proteínov pomocou gélovej filtrácie je fakt, že do pórovitej matrice môžu vstúpiť len molekuly, ktoré sú menšie ako je veľkosť pórov. Naproti tomu, veľké molekuly prechádzajú kolónou pomedzi tieto guličky viac-menej bez zdržania. Z toho dôvodu trvá "cesta" menším proteínom kolónou dlhšie ako väčším proteínom. Na opačnej strane kolóny sa nachádza ventil, pomocou ktorého odoberáme jednotlivé eluáty v čase. Rozdielom oproti ostatným chromatografickým separačným technikám je to, že celá separácia prebieha v jednom roztoku, ktorého zloženie sa nemení.

Tento efekt prechodu menších molekúl do pórovitej štruktúry matrice sa môže využiť ako určitá alternatíva dialýzy. Soli, hoci by sa mohlo zdať, že pretečú kolónou najrýchlejšie, sú najviac zbrzdené v tejto pórovitej matrici (pretože sú najmenšie), takže v skutočnosti prechádzajú matricou najpomalšie. Gélová filtrácia sa za týmto účelom hodí predovšetkým na prečisťovanie väčších proteínov od kontaminujúcich solí.

Na ekvilibrovanú kolónu nanesieme vzorku proteínu a postupne pridávame rozpúšťadlo. Vysokomolekulové proteíny, keďže prechádzajú pomedzi guličky bez zdržania, sa eluujú už zhruba 30% objemom rozpúšťadla (vzhľadom na objem celej kolóny). Toto číslo teda koreluje s objemom mobilnej fázy. Ďalším pridávaním roztoku sa postupne separujú frakcie stredne veľkých proteínov. Nakoniec, keď je objem pridaného rozpúšťadla približne rovný objemu kolóny (t.j. súčet objemu mobilnej a stacionárnej fázy) (angl. column volume, cv = objem kolóny), dôjde k elúcii aj nízko-molekulových proteínov a molekúl.

Komerčne dostupné matrice ponúkajú rôzne efektívne rozdeľovanie proteínov v určitej veľkostnej oblasti - tzv. frakcionačný rozsah. Dôležitým parametrom každej matrice je aj veľkosť pórov, resp. minimálna veľkosť molekúl (angl. exclusion limit), ktoré sú už priveľké na to, aby sa dostali do stacionárnej fázy. Každá matrica má určitý maximálny operačný tlak, ktorým pôsobíme na kolónu, aby sme urýchlili separáciu.

Tab. Niektoré vybrané komerčné označenia matríc pre gélovú filtráciu (firma GE Healthcare)
materiálproduktfrakcionačný rozsah
[kDa]
výhodynevýhody
dextranSephadex G-100 - 0,7G-10 sú vhodné na odstránenie solí z roztoku.Len gravitačný spád.
Sephadex G-251 - 5G-25 sú vhodné na odstránenie solí z roztoku.Len gravitačný spád.
Sephadex G-501,5 - 30Len gravitačný spád.
Sephadex G-1004 - 150Len gravitačný spád.
Sephadex G-2005 - 600Len gravitačný spád.
agarózaSepharose 6B10 - 4000Separácia väčších proteínov.Nesmú vyschnúť.
Sepharose 4B60 - 20000Separácia väčších proteínov.Nesmú vyschnúť.
Sepharose CL-4B60 - 20000Separácia väčších proteínov.Nesmú vyschnúť.
Sepharose CL-2B70 - 40000Separácia väčších proteínov.Nesmú vyschnúť.
alyl-dextrán + bisakrylamidSephacryl S-200 HR5 - 250Nie sú biodegradovateľné, mechanicky pevné.Nesmú vyschnúť.
Sephacryl S-300 HR 1010 - 1500Nie sú biodegradovateľné, mechanicky pevné.Nesmú vyschnúť.
Sephacryl S-400 HR 2020 - 8000Nie sú biodegradovateľné, mechanicky pevné.Nesmú vyschnúť.

Zdroj: Fágáin C.Ó. et al.: Gel-Filtration Chromatography. (2010). In: Methods in Molecular Biology, vol. 681, pp. 25-33

Mnohé z týchto matríc (napr. Sephadex, Sepharose) sa používajú aj v ostatných technikách chromatografie, s tým rozdielom, že sú kovalentne spojené s ligandom s povrchovým nábojom alebo s hydrofóbnou skupinou.

V závislosti od chemickej povahy tlmivého roztoku (rozpúšťadla), rozlišujeme:

  • gélovú filtráciu s vodným rozpúšťadlom (angl. gel filtration chromatography, GFC)
  • gélovú filtráciu s organickým rozpúšťadlom (angl. gel permeation chromatography, GPC)

Výhodou gélovej filtrácie je možnosť použitia širokej škály tlmivých roztokov a nulové straty, keďže samotné proteíny s matricou chemicky neinteragujú. Nevýhodou je vysoká cena kolón, malý objem nanášanej vzorky proteínu (menej ako 1% objemu kolóny), takže eluát obsahuje veľmi zriedenú vzorku, ktorú treba následne precipitovať. Gélová filtrácia väčšinou nie je vhodným začiatočným krokom purifikácie z komplexnej proteínovej zmesi.