Biopedia.sk logo
© Biopedia.sk 2024

Separácia proteínov - hydrofóbna chromatografia

Autor:
Publikované dňa:

Citácia: PANČÍK, Peter. 2016. Biopedia.sk: Separácia proteínov - hydrofóbna chromatografia. [cit. 2024-12-05]. Dostupné na internete: <https://biopedia.sk/molekularna-biologia/hydrofobna-chromatografia>.

Princíp hydrofóbnej chromatografie (angl. hydrophobic-interaction chromatography, HIC) je podobný ako v prípade chromatografie v reverznej fáze, pretože využíva separáciu proteínov na základe hydrofobicity. Základným rozdielom je, že pri HIC nepracujeme s tak veľmi hydrofóbnym nosičom ako pri RPC, takže dokážeme eluovať proteíny pomocou zmeny zloženia alebo koncentrácie soli v mobilnej fáze, zmenou pH alebo teploty, čím sú zachované jeho biologické vlastnosti. Niekedy sa preto táto metóda nazýva aj "miernejšia RPC", i keď sa v niektorých veciach tieto metódy podstatne odlišujú.

RPCHIC
ligandviac hydrofóbnymálo hydrofóbny
hydrofóbna interakciasilnáslabá
elúcianepolárne, organické rozpúšťadlopolárny, vodný tlmivý roztok
aktivita proteínudenaturovaný proteínnatívny proteín
operačný tlakvysoký tlak (HPLC)nízky tlak
Tab. Hydrofóbna chromatografia (HIC) vs. chromatografia v reverznej fáze (RPC)

Zdroj: Karlström, A.E.: Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC), Reversed-Phase Chromatography (RPC). KTH Royal Institute of Technology, School of Biotechnology, AlbaNova University Center, Stockholm

Matricou v hydrofóbnej chromatografii je polysacharid (agaróza, celulóza alebo dextran), silikagél alebo syntetické kopolyméry. Ligandom sú lineárne alkány (C1-C8), aromatické skupiny (fenyl) alebo polyétery (PEG).

Väzba proteínov na matricu nastáva v prostredí s vysokou koncentráciou soli (fosforečnanové alebo síranové anióny), ktoré "odsáva" z povrchu proteínu vodu, a to potom vedie k agregácii hydrofóbnych povrchov ako aj k ich väzbe na hydrofóbnu matricu. Tento tzv. salting-out efekt je známy aj z precipitácie proteínov pomocou síranu amónneho. Na druhej strane, niektoré molekuly (horečnaté alebo vápenaté ióny) spôsobujú opačný salting-in efekt, ktorý znižuje hydrofóbne interakcie prostredníctvom narušenia sieťovitej štruktúry molekúl vody, usporiadaných okolo hydrofóbneho povrchu proteínov. Elúciu podporuje aj zníženie povrchového napätia vodného roztoku, teploty roztoku, prípadne zmena pH (v závislosti od izoelektrického bodu proteínu).

Po nanesení zmesi proteínov na ekvilibrovanú chromatografickú kolónu je mobilnou fázou koncentrovaný roztok síranu amónneho, ktorý agreguje hydrofóbne oblasti proteínov, ako aj podporuje ich väzbu s hydrofóbnym ligandom matrice. Hydrofilné proteíny v tejto fáze pretečú kolónou bez väzby na matricu. Postupným znižovaním koncentrácie síranu amónneho dochádza k elúcii slabo hydrofóbnych proteínov. Silne viazané proteíny sú z kolóny vymyté až roztokom bez obsahu soli. Kolóna sa znovu ekvilibruje roztokom síranu amónneho.

HIC je dobrou voľbou prvotnej purifikácie proteínov z proteínovej zmesi. Separácia prebieha pri nízkom tlaku.

Ďalšie články

Separácia proteínov - gélová filtrácia

Separácia proteínov - gélová filtrácia

Gélová filtrácia umožňuje separáciu proteínov na základe ich veľkosti. Chromatografická kolóna je naplnená chemicky inertnými, polysacharidovými alebo polyakrylamidovými, pórovitými guličkami tvoriacimi gélovitú hmotu. Princíp separácie spočíva v tom, že menšie molekuly musia prekonať dlhšiu dráhu, pretože vchádzajú do pórov guľôčok, čo predlžuje ich čas, dokedy ostávajú v kolóne. Táto technika sa hodí aj na odsoľovanie proteínovej suspenzie.

Separácia proteínov - ionomeničová chromatografia

Separácia proteínov - ionomeničová chromatografia

Ionomeničová chromatografia zabezpečuje separáciu proteínov na základe ich náboja. Z toho dôvodu je chromatografická matrica nabitá buď kladne (anex - lebo viaže anióny) alebo záporne (katex - lebo viaže katióny). Elúciu proteínov zabezpečuje zmena koncentrácie soli v roztoku, čo ovplyvňuje iónovú silu.

Separácia proteínov - chromatografia v reverznej fáze

Separácia proteínov - chromatografia v reverznej fáze

Chromatografia v normálnej fáze spočíva v interakcii matrice s hydrofilnými povrchmi proteínov, pričom mobilnou fázou je nepolárne rozpúšťadlo (napr. chloroform). Chromatografia v reverznej fáze je presným opakom: matrica interaguje s hydrofóbnymi povrchmi proteínov a mobilnou fázou je najčastejšie metanol alebo acetonitril. Výhodou chromatografie v reverznej fáze je možnosť separácie širokého spektra molekúl, vrátane nabitých a polárnych molekúl, nevýhodou je denaturácia proteínov.

Separácia proteínov - afinitná chromatografia

Separácia proteínov - afinitná chromatografia

Princípom afinitnej chromatografie je špecifická väzba určitého štruktúrneho proteínového motívu so špecifickým ligandom, kovalentne naviazaným na matricu. Je to teda princíp väzby protilátok s antigénom - "kľúč a zámok". Proteíny bez tohto motívu sa za ideálnych podmienok na matricu neviažu, takže selektivita a vysoká rozlišovacia schopnosť, ako aj kapacita kolóny, sú pri tejto separačnej technike veľmi vysoké.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC)

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC)

HPLC nie je ani tak samostatná chromatografická metóda, ako zdokonalenie chromatografických techník za účelom efektívnejšej a rýchlejšej separácie analytov. Výhodou je predovšetkým úspora času. V ostatných desaťročiach je hojne používaná na analytickú separáciu peptidov a proteínov, ich kvantifikáciu a charakterizáciu. Väčšie kolóny majú využitie aj pri preparatívnej separácii.

Denaturačná elektroforéza proteínov v polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE)

Denaturačná elektroforéza proteínov v polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE)

Elektroforetická separácia proteínov v najjednoduchšej forme prebieha vo vertikálnej elektroforetickej aparatúre v prostredí polyakrylamidového gélu (PAGE) a za prítomnosti silného detergentu dodecylsulfátu sodného (SDS). Vlastnosťou SDS je pokrytie celého povrchu proteínov záporným nábojom, takže separácia proteínov prebieha bez ohľadu na ich prirodzený náboj alebo terciárnu štruktúru - t.j. len na základe ich veľkosti, resp. hmotnosti.

forward