Separácia proteínov - hydrofóbna chromatografia

Princíp hydrofóbnej chromatografie (angl. hydrophobic-interaction chromatography, HIC) je podobný ako v prípade chromatografie v reverznej fáze, pretože využíva separáciu proteínov na základe hydrofobicity. Základným rozdielom je, že pri HIC nepracujeme s tak veľmi hydrofóbnym nosičom ako pri RPC, takže dokážeme eluovať proteíny pomocou zmeny zloženia alebo koncentrácie soli v mobilnej fáze, zmenou pH alebo teploty, čím sú zachované jeho biologické vlastnosti. Niekedy sa preto táto metóda nazýva aj "miernejšia RPC", i keď sa v niektorých veciach tieto metódy podstatne odlišujú.

Tab. Hydrofóbna chromatografia (HIC) vs. chromatografia v reverznej fáze (RPC)
RPCHIC
ligandviac hydrofóbnymálo hydrofóbny
hydrofóbna interakciasilnáslabá
elúcianepolárne, organické rozpúšťadlopolárny, vodný tlmivý roztok
aktivita proteínudenaturovaný proteínnatívny proteín
operačný tlakvysoký tlak (HPLC)nízky tlak

Zdroj: Karlström, A.E.: Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC), Reversed-Phase Chromatography (RPC). KTH Royal Institute of Technology, School of Biotechnology, AlbaNova University Center, Stockholm

Matricou v hydrofóbnej chromatografii je polysacharid (agaróza, celulóza alebo dextran), silikagél alebo syntetické kopolyméry. Ligandom sú lineárne alkány (C1-C8), aromatické skupiny (fenyl) alebo polyétery (PEG).

Väzba proteínov na matricu nastáva v prostredí s vysokou koncentráciou soli (fosforečnanové alebo síranové anióny), ktoré "odsáva" z povrchu proteínu vodu, a to potom vedie k agregácii hydrofóbnych povrchov ako aj k ich väzbe na hydrofóbnu matricu. Tento tzv. salting-out efekt je známy aj z precipitácie proteínov pomocou síranu amónneho. Na druhej strane, niektoré molekuly (horečnaté alebo vápenaté ióny) spôsobujú opačný salting-in efekt, ktorý znižuje hydrofóbne interakcie prostredníctvom narušenia sieťovitej štruktúry molekúl vody, usporiadaných okolo hydrofóbneho povrchu proteínov. Elúciu podporuje aj zníženie povrchového napätia vodného roztoku, teploty roztoku, prípadne zmena pH (v závislosti od izoelektrického bodu proteínu).

Po nanesení zmesi proteínov na ekvilibrovanú chromatografickú kolónu je mobilnou fázou koncentrovaný roztok síranu amónneho, ktorý agreguje hydrofóbne oblasti proteínov, ako aj podporuje ich väzbu s hydrofóbnym ligandom matrice. Hydrofilné proteíny v tejto fáze pretečú kolónou bez väzby na matricu. Postupným znižovaním koncentrácie síranu amónneho dochádza k elúcii slabo hydrofóbnych proteínov. Silne viazané proteíny sú z kolóny vymyté až roztokom bez obsahu soli. Kolóna sa znovu ekvilibruje roztokom síranu amónneho.

HIC je dobrou voľbou prvotnej purifikácie proteínov z proteínovej zmesi. Separácia prebieha pri nízkom tlaku.