Separácia proteínov - chromatografia v reverznej fáze

Chromatografia v normálnej fáze je termín používaný na separáciu molekúl, využívajúc interakciu hydrofilných, polárnych charakteristických skupín s hydrofilnou matricou chromatografickej kolóny, pričom mobilnou fázou je nepolárne rozpúšťadlo, napr. chloroform (HC-Cl3). Táto technika sa používa na separáciu malých, organických analytov, ale nehodí sa príliš na separáciu veľkých proteínov.

Na druhej strane, chromatografia v reverznej fáze (angl. reversed-phase chromatography, RPC) využíva na separáciu hydrofóbne povrchy proteínu, ktoré interagujú s hydrofóbnym ligandom. Hydrofobicitu proteínu reprezentujú predovšetkým postranné reťazce aminokyselín izoleucín, valín, leucín, fenylalanín, cysteín, metionín a tryptofán. Mobilnou fázou je vysoko polárne rozpúšťadlo.

Tab. Chromatografia v normálnej vs. reverznej fáze
normálna fázareverzná fáza
charakteristická skupina liganduhydrofilnáhydrofóbna
interakcie s matricouhydrofilnéhydrofóbne
počiatočná mobilná fázanepolárnavysoko polárna
elúciapolárne rozpúšťadlonepolárne rozpúšťadlo

Matricou pri RPC je silikagél alebo syntetický kopolymér (polystyrén), ktoré dokážu odolať vyššiemu operačnému tlaku. Menšie guličky zabezpečujú lepšie rozlíšenie. Výber ligandu závisí od hydrofóbneho charakteru proteínu, ktorý chceme purifikovať. Matrice s dlhým postranným hydrofóbnym reťazcom (napr. C18) viažu proteíny veľmi pevne, zatiaľ čo reťazce C4, príp. aromatická fenylová skupina, sú voľnejšie vo väzbe, takže viažu len silne hydrofóbne proteíny. Vo všeobecnosti je dobré začať s matricou s nízkou hydrofobicitou.

Znížením polarity mobilnej fázy - postupnou výmenou za nepolárne, organické rozpúšťadlo, klesá interakcia hydrofóbnych oblastí proteínov s matricou a dochádza k ich elúcii. Čím je proteín hydrofóbnejší, tým väčší objem organického rozpúšťadla treba použiť na jeho elúciu. Najpoužívanejšie rozpúšťadlo je acetonitril (H3C-C≡N) alebo metanol (H3C-OH).

Po ekvilibrácii kolóny nanášame roztok proteínu. Na kolóne sa zachytia len hydrofóbne molekuly. Postupným zvyšovaním koncentrácie organického rozpúšťadla (0-100%) dosiahneme postupné vytesňovanie proteínov z matrice. Najsilnejšie interakcie možno prerušiť až po niekoľkých krokoch premývania 100% rozpúšťadlom. Napokon kolónu znovu ekvilibrujeme roztokom polárneho charakteru, príp. organickým rozpúšťadlom s veľmi nízkou koncentráciou.

Výhodou chromatografie v reverznej fáze je možnosť separácie širokého spektra molekúl, vrátane nabitých a polárnych molekúl, dôsledné riadenie podmienok separácie (typ rozpúšťadla, koncentrácia, pH, teplota), vysoká stabilita a efektivita kolón a robustnosť. Táto metóda je vhodná pre analytické účely, ale príliš sa nehodí na purifikáciu proteínu za účelom štúdia jeho biologických vlastností, pretože organické rozpúšťadlo môže spôsobiť jeho denaturáciu. Využíva sa predovšetkým pri technike HPLC, ktorá proteíny separuje pod vyšším tlakom mobilnej fázy. Alternatívou k RPC je hydrofóbna chromatografia (HIC).