Separácia proteínov - afinitná chromatografia

Princípom afinitnej chromatografie je špecifická väzba (afinita) určitého štruktúrneho proteínového motívu so špecifickým ligandom, kovalentne naviazaným na matricu. Je to teda princíp väzby protilátok s antigénom - "kľúč a zámok". Proteíny bez tohto motívu sa za ideálnych podmienok na matricu neviažu, takže selektivita a vysoká rozlišovacia schopnosť, ako aj kapacita kolóny, sú pri tejto separačnej technike veľmi vysoké. V praxi je však často potrebné hľadať optimálne zloženie premývacieho roztoku (najmä s ohľadom na iónovú silu), ktorý odstráni nešpecificky naviazané proteíny. Väzba proteínu s matricou je dočasná (reverzibilná), takže so zmenou zloženia mobilnej fázy je proteín z kolóny vytesnený. Elučný roztok pôsobí nešpecificky, t.j. zmenou iónovej sily, pH alebo polarity, alebo vyviazanie proteínu spôsobuje väzba s kompetitívnym ligandom.

Špecifická väzba proteínu s určitým ligandom by sa, po správnosti, mala nazývať avidita. Avidita predstavuje komplexnú, tzv. funkčnú afinitu, čo je súčet jednotlivých medzimolekulových interakcií (t.j. proteín-ligand). Interakciu proteínu s ligandom pri afinitnej chromatografii totiž zabezpečuje viacero väzieb, resp. afinít, ktoré sú dané špecifickým trojrozmerným rozmiestnením aminokyselín.

Príklad väzby proteínu na matricu s kovalentne naviazanou glukózou. Glukóza predstavuje pre daný proteín prirodzený substrát, takže tento fakt môže byť využitý pri jeho selektívnej purifikácii. Po odmytí ostatných kontaminujúcich proteínov možno predmetný proteín z matrice vytesniť (eluovať) roztokom glukózy.

Po ekvilibrácii matrice a aplikácii analytu na kolónu dochádza k väzbe rekombinantného proteínu na matricu, pričom zvyšné proteíny kolónou len pretečú. (Následne možno pomocou premývacieho roztoku vytesniť z matrice aj nešpecificky naviazané proteíny.) Elúciu špecificky naviazaného proteínu spôsobí zámena tlmivého roztoku za elučný roztok. Matricu je zväčša potrebné po separácii regenerovať použitím špeciálneho roztoku.

V afinitnej chromatografii využívame niekoľko typov ligandov, ktoré možno použiť na purifikáciu špecifických proteínov alebo skupín proteínov. Vo všeobecnosti sa jedná o purifikáciu proteínov na základe ich reverzibilnej väzby s ligandom, ktorým je buď prirodzený substrát alebo jeho derivát (analóg).

Tab. Niektoré najpoužívanejšie ligandy afinitnej chromatografie
ligand matriceafinita kpoznámka
imunoglobulínyšpecifický substrátImunoafinitná chromatografia. IgG sú veľmi často viazané na matricu prostredníctvom väzby s rekombinantným bakteriálnym proteínom A alebo G, ktoré špecificky viažu Fc reťazce IgG rôzneho pôvodu. Elúcia proteínu (antigénu) z protilátky pomocou nízkeho pH (<2,7). Antigénom môžu byť aj väčšie častice, napr. virióny alebo bakteriálne bunky.
lektíny (napr. konkanavalín A)glykoproteínyLektíny sú proteíny, ktoré viažu niektoré monosacharidy. Štúdium glykozylácie proteínov.
nukleová kyselinaproteíny viažúce sa na DNAVhodné napr. na purifikáciu transkripčných faktorov.

Purifikácia rekombinantných proteínov - proteínové kotvy

Nie každý proteín je možné prirodzene separovať pomocou tejto techniky. Využitie afinitnej chromatografie je predovšetkým v preparatívnej separácii rekombinantného proteínu. Svojimi vlastnosťami je vhodná aj pre purifikáciu rekombinantného proteínu z komplexnej proteínovej zmesi, ako v malej (angl. small-scale purification), tak aj vo veľkej mierke (angl. large-scale purification).

Rekombinantné proteíny sú cielene exprimované proteíny prostredníctvom nejakého expresného systému. Najčastejšie sú zložené z dvoch častí, preto im hovoríme fúzne proteíny:

  1. samotný čítací rámec proteínu
  2. proteínová kotva (tzv. proteínový prívesok, proteínový tag)

Proteínová kotva v podstate predstavuje len pokračovanie čítacieho rámca proteínu v podobe ďalších aminokyselín, ktoré vytvárajú určitý štruktúrny alebo funkčný motív, umožňujúci purifikáciu proteínu pomocou rôznych afinitných matríc. Proteínová kotva môže byť rôzne veľká (0,8-40 kDa). Vhodný purifikačný systém musí spĺňať niekoľko kritérií:

  • proteínová kotva (spolu s proteínom) sa musí špecificky a reverzibilne viazať na vhodný nosič (matricu)
  • purifikácia nesmie byť časovo ani technicky náročná
  • výsledná kotva by nemala mať výrazný vplyv na celkový tvar (konformáciu) a funkciu proteínu, príp. by mala byť dodatočne odštiepiteľná vhodným enzýmom (proteázou)
Proteínová kotva sa môže nachádzať na začiatku alebo na konci proteínu, t.j. na C- alebo N-terminálnom konci polypeptidového reťazca. V prípade, že lokalizácia tejto kotvy neovplyvňuje biologickú funkciu proteínu, je vhodnejšie, ak sa nachádza na N-terminálnom konci, pretože tak vieme selektovať všetky nekompletne nasyntetizované molekuly. Nekompletný polypeptid sa jednoducho na afinitnú matricu nenaviaže, pretože mu chýba koniec, na ktorom je predmetná proteínová kotva.
Tab. Niektoré najpoužívanejšie peptidové a proteínové kotvy
ligand matriceproteínová
kotva
veľkosť kotvy
[kDa]
počet AKpoznámka
Peptidové kotvy
napr. Ni2+, Zn2+, Co2+6×His-tag0,86Metalo-chelátová afinitná chromatografia. Základná, technicky najmenej náročná a lacná purifikácia rekombinantného proteínu. Elučný roztok so >50 mM imidazolom.
protilátkaFLAG-tag1,018Imunoafinitná purifikácia. FLAG je jedna z prvých proteínových kotiev, ktorá bola patentovaná (1987). Elúcia pri pH = 3,0 alebo 2-5 mM EDTA. V prípade lokalizácie kotvy na C-terminálnom konci je dodatočne prirodzene oštiepiteľná pomocou enterokinázy, pretože predstavuje jej rozpoznávajúcu sekvenciu.
protilátkaT7-tag1,111Imunoafinitná purifikácia. T7-tag predstavuje sekvenciu z hlavného kapsidového proteínu bakteriofágu T7 a je súčasťou mnohých rekombinantných expresných vektorov využívajúcich T7 RNA-polymerázu.
protilátkac-myc1,2011Imunoafinitná purifikácia. Elúcia pomocou nízkeho pH.
protilátkaS-tag1,7515Imunoafinitná purifikácia. S-tag je oligopeptid derivovaný z pankreatickej RNázy A. Môže zvyšovať solubilitu fúzneho proteínu, pretože obsahuje veľa polárnych a nabitých aminokyselín.
kalmodulínkalmodulín-viažúci peptid (CBP)2,9626Fúzne proteíny s CBP majú vyššiu solubilitu. CBP viaže kalmodulín na matrici pri neutrálnom pH a nízkej koncentrácii vápenatých katiónov. Elúcia taktiež prebieha pri neutrálnom pH, s prídavkom 2 mM EGTA, ktorá vychytáva Ca2+.
Proteínové kotvy
glutatiónglutatión-S-transferáza (GST)26211Podporuje solubilitu rekombinantného proteínu, efektívna, ale drahá purifikácia. Elúcia s 5-10 mM redukovaným glutatiónom (GSH).
amylózamaltózu-viažúci proteín (MBP)40396MBP je bakteriálny proteín, ktorý je zapojený do metabolizmu maltodextrínov (oligosacharidov). Proteínová kotva s MBP zvyšuje solubilitu fúzneho proteínu. Elúcia proteínov pomocou 10 mM maltózy.
-tioredoxín E. coli (TrxA)11,7109Potenciálne zvyšujú solubilitu fúzneho rekombinantného proteínu exprimovaného v bakteriálnom expresnom systéme. Neexistuje však pre ne vhodná, špecifická afinitná matrica. Z toho dôvodu je nutné použiť na ich selektívnu purifikáciu ďalšiu, menšiu peptidovú kotvu, napr. 6×His-tag. Keďže sú tieto proteínové kotvy veľké, je nutné ich odštiepiť pomocou špecifickej proteázy.
-proteín-disulfid izomeráza I (DsbA)23,1208Potenciálne zvyšujú solubilitu fúzneho rekombinantného proteínu exprimovaného v bakteriálnom expresnom systéme. Neexistuje však pre ne vhodná, špecifická afinitná matrica. Z toho dôvodu je nutné použiť na ich selektívnu purifikáciu ďalšiu, menšiu peptidovú kotvu, napr. 6×His-tag. Keďže sú tieto proteínové kotvy veľké, je nutné ich odštiepiť pomocou špecifickej proteázy.
-transkripčný terminátor-antiterminátor fágu λ (NusA)54,9495Potenciálne zvyšujú solubilitu fúzneho rekombinantného proteínu exprimovaného v bakteriálnom expresnom systéme. Neexistuje však pre ne vhodná, špecifická afinitná matrica. Z toho dôvodu je nutné použiť na ich selektívnu purifikáciu ďalšiu, menšiu peptidovú kotvu, napr. 6×His-tag. Keďže sú tieto proteínové kotvy veľké, je nutné ich odštiepiť pomocou špecifickej proteázy.

Zdroj:

  1. Pančík P.: M3 proteín Myšieho herpetického vírusu, nový modulátor imunitnej odpovede. (2013). Virologický ústav Slovenskej akadémie vied, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava. Dizertačná práca.
  2. Page R.: Strategies for Maximizing Heterologous Protein Expression in E. coli with Minimal Cost. (2007). Department of Molecular Biology, Biochemistry and Cell Biology, Brown University, Providence, Rhode Island
  3. Protein tag - Wikipedia, Free Encyclopedia

Biotín predstavuje osobitnú skupinu značenia proteínov. Biotín je známy ako vitamín H, ktorý zohráva úlohu pri metabolizme mastných kyselín, aminokyselín a glukózy. Má široké uplatnenie v biotechnológiách, pretože zabezpečuje veľmi pevnú, špecifickú väzbu s ligandom, ktorým je streptavidín (avidín). Značenie proteínov biotínom sa nazýva biotinylácia. Purifikácia biotinylovaných proteínov si však často vyžaduje elúciu za denaturujúcich podmienok (6M GuHCl, pH = 1,5), pretože je táto väzba veľmi pevná. Na druhej strane, malá veľkosť biotínu (244 Da) málokedy vyžaduje jeho dodatočné odštiepenie z rekombinantného proteínu.

V niektorých prípadoch je potrebné proteínovú kotvu odštiepiť, aby bolo možné obnoviť biologickú aktivitu exprimovaného rekombinantného proteínu. Toto štiepenie zabezpečujú špeciálne proteázy, ktoré rozoznávajú určitý sekvenčný alebo štruktúrny motív. Tieto sekvencie sú spravidla súčasťou expresných vektorov (napr. bakteriálny expresný systém pET).

Tab. Niektoré najčastejšie používané proteázy a ich rozpoznávajúce sekvencie
menopôvodtyprozpoznávajúca sekvencia
[1-písmenový kód]
HRV 3Cľudský vírus nádchycysteínová proteázaLEVLFQG▼P
enterokinázaľudský tráviaci enzým z dvanástnikaserínová proteázaDDDDK▼X
TEVTobacco Etch Viruscysteínová proteázaENLYFQG▼S
faktor Xkoagulačný faktor Xserínová proteázaI(E/D)GR▼
trombínkoagulačný faktor IIserínová proteázaLVPA▼GS
TAGZymeDAPáza (+ Qcykláza)exopeptidázašpecifická pre 6×His-tag (firma Qiagen)
SUMOubikvitínu-podobná proteázacysteínová proteázarozoznáva štruktúrny motív

Zdroj:

  1. Protein Expression Facility, University of Queensland, Australia
  2. Lebendiker M.: Cleavage Sites Table for Fusion Proteins. (2002). Protein Purification Facility. Wolfson Centre for Applied Structural Biology, The Hebrew University of Jerusalem, Izrael

Z tabuľky vyplýva, že napriek enzymatickému odštiepeniu proteínovej kotvy ostáva niekoľko aminokyselín, tvoriach rozpoznávajúce miesto pre proteázu, stále pripojených k rekombinantnému proteínu, čo môže, ale nemusí ovplyvňovať jeho biologickú aktivitu. Zároveň treba dbať na prípadné prečistenie proteínovej zmesi od nepoštiepených molekúl, pretože tento proces nie je nikdy efektívny na 100% (napr. v prípade enterokinázy závisí od prvej aminokyseliny X v pozícii za štiepnym miestom). Dizajn rekombinantného proteínu a postupu jeho purifikácie by sa tak mal predovšetkým opierať o menšie kotvy (napr. 6×His-tag, biotín).

Metalo-chelátová afinitná chromatografia

Technika metalo-chelátovej afinitnej chromatografie (angl. immobilized metal affinity chromatography, IMAC) vychádza z interakcie histidínovej peptidovej kotvy (6×His-tag) s matricou, ktorú tvoria 3 zložky:

  1. polysacharidový nosič - najčastejšie agaróza (napr. Sepharose CL-6B pri Ni-NTA Agarose od firmy Qiagen)
  2. kyselina imino-dioctová (IDA) alebo kyselina nitrilo-trioctová (NTA)
  3. chelatačný ligand, ktorý interaguje s postrannými reťazcami aminokyseliny histidínu - dvojmocný katión kovového prvku (najčastejšie Ni2+)

Histidínová kotva sa môže nachádzať na C- alebo N-terminálnom konci rekombinantného proteínu, alebo kdekoľvek v jeho čítacom rámci, nemala by však ovplyvniť jeho natívnu konformáciu a biologickú aktivitu. Napriek veľkej špecificite matrice k tejto peptidovej kotve, často dochádza ku kopurifikácii kontaminujúcich proteínov. Jej rozsah súvisí predovšetkým s chelatačným potenciálom kovového prvku ale aj samotnou matricou. Vzhľadom na ión kovu, klesá špecificita (a vzrastá množstvo kopurifikujúcich, kontaminujúcich proteínov) približne takto:

Ni2+ > Co2+ > Zn2+ > Cu2+

NTA je špecifickejšia v tom zmysle, že tvorí o jednu koordinačnú väzbu s kovovým prvkom naviac, v porovnaní s IDA. To môže mať za následok nižší výťažok, ale o to špecifickejšiu interakciu s rekombinantným proteínom.

Elúcia prebieha najčastejšie použitím kompetitívneho ligandu, ktorým je imidazol v koncentrácii väčšinou >50 mmol/l. Pri purifikácii proteínov sa nesmie použiť EDTA, ani iné podobné chelatačné činidlo, pretože by vyviazalo kovový prvok z matrice a separácia by bola neúspešná.