Denaturačná elektroforéza proteínov v polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE)

Autor:
Publikované dňa:

Citácia: PANČÍK, Peter. 2016. Biopedia.sk: Denaturačná elektroforéza proteínov v polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE). [cit. 2024-05-29]. Dostupné na internete: <https://biopedia.sk/molekularna-biologia/sds-page>.

SDS-PAGE (angl. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) je technika elektroforetickej separácie proteínov v polyakrylamidovom géli (množstvo akrylamid-bisakrylamidu je 6-15%) s použitím denaturačného činidla - SDS (sodium dodecyl sulfát). Používa sa na sledovanie účinnosti purifikačných postupov (je proteín očakávanej veľkosti prítomný na géli? sú prítomné kontaminujúce proteíny?). Princípom tejto techniky je separácia proteínov na základe ich veľkosti, bez ohľadu na konformáciu alebo náboj proteínu. SDS narušuje terciárnu a sekundárnu štruktúru proteínu tým, že sa viaže na jeho povrch a zároveň ho pokrýva negatívnym nábojom, takže polypeptidové reťazce migrujú v polyakrylamidovom géli ku kladne nabitej anóde. SDS je súčasťou nanášacieho tlmivého roztoku, ktorý sa pridáva do roztoku proteínu a inkubuje pri 100°C / 5-10 min.

Jediné, čo SDS nedokáže, je redukovať disulfidické väzby S-S. Do nanášacieho tlmivého roztoku sa preto pridáva redukujúce činidlo, napr. ditiotreitol (DTT) alebo beta-merkaptoetanol (βME).

Kompletné zloženie nanášacieho roztoku je nasledovné:

60 mM Tris-Cl, pH = 6,8
2% (w/v) SDS
10% (v/v) glycerol
5% (v/v) β-merkaptoetanol
0,05% brómfenolová modrá

Elektroforéza prebieha najčastejšie v Tris-glycín-SDS tlmivom roztoku:

25 mM Tris
192 mM glycín
0,1% (w/v) SDS

Samotné proteínové prúžky nie sú počas migrácie v géli viditeľné. Zviditelňujú (vizualizujú) sa najčastejšie pomocou modrej farbičky Coomassie Brilliant Blue R-250. Zloženie farbiaceho roztoku je nasledovné:

50% (v/v) metanol
10% (v/v) kyselina octová
0,15% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250

Takýto roztok zafarbí celý gél, nielen proteíny. Následne však prebytočnú farbičku vymyjeme odfarbovacím roztokom, takže po chvíli ostanú zafarbené len proteíny:

15% (v/v) metanol
10% (v/v) kyselina octová

Ďalšie články

Separácia proteínov - hydrofóbna chromatografia

Princíp hydrofóbnej chromatografie (HIC) je podobný ako v prípade chromatografie v reverznej fáze (RPC), pretože využíva separáciu proteínov na základe hydrofobicity. Základným rozdielom je, že pri HIC nepracujeme s tak veľmi hydrofóbnym nosičom ako pri RPC, takže dokážeme eluovať proteíny pomocou zmeny zloženia alebo koncentrácie soli v mobilnej fáze, zmenou pH alebo teploty, čím sú zachované jeho biologické vlastnosti.

Separácia proteínov - afinitná chromatografia

Princípom afinitnej chromatografie je špecifická väzba určitého štruktúrneho proteínového motívu so špecifickým ligandom, kovalentne naviazaným na matricu. Je to teda princíp väzby protilátok s antigénom - "kľúč a zámok". Proteíny bez tohto motívu sa za ideálnych podmienok na matricu neviažu, takže selektivita a vysoká rozlišovacia schopnosť, ako aj kapacita kolóny, sú pri tejto separačnej technike veľmi vysoké.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC)

HPLC nie je ani tak samostatná chromatografická metóda, ako zdokonalenie chromatografických techník za účelom efektívnejšej a rýchlejšej separácie analytov. Výhodou je predovšetkým úspora času. V ostatných desaťročiach je hojne používaná na analytickú separáciu peptidov a proteínov, ich kvantifikáciu a charakterizáciu. Väčšie kolóny majú využitie aj pri preparatívnej separácii.

forward