Polyakrylamidová gélová elektroforéza (SDS-PAGE)

SDS-PAGE (angl. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) je jedna z najrozšírenejších a najdôležitejších analytických metód v biochémii, molekulárnej biológii a proteomike. Slúži na elektroforetickú separáciu proteínov v polyakrylamidovom géli (s koncentráciou akrylamid-bisakrylamidu zvyčajne 6–15 %) na základe ich molekulovej hmotnosti, pričom eliminuje vplyv ich tvaru, konformácie a vlastného elektrického náboja.

V laboratórnej praxi slúži SDS-PAGE najmä na kontrolu čistoty a priebehu purifikácie (odhalenie kontaminantov), presné určenie molekulovej hmotnosti porovnaním s proteínovým štandardom (tzv. protein ladder) a analýzu podjednotiek — porovnanie redukujúcich a neredukujúcich podmienok totiž odhalí, či sú reťazce spojené disulfidickými mostíkmi. Vyseparované proteíny v géli navyše bežne slúžia ako východisko pre western blot alebo vyrezanie pásika pre identifikáciu pomocou hmotnostnej spektrometrie (MS).

Fyzikálno-chemický princíp separácie link

Pri natívnej elektroforéze migrujú proteíny v elektrickom poli na základe kombinácie troch faktorov: (1) svojej veľkosti, (2) trojrozmerného tvaru (konformácie) a (3) celkového čistého náboja. SDS-PAGE tento proces zjednocuje tak, že zo separácie úplne vylučuje tvar a vlastný náboj:

1. denaturácia a linearizácia štruktúry – aniónový detergent SDS (angl. sodium dodecyl sulfate, dodecylsíran sodný) narušuje sekundárnu a terciárnu štruktúru proteínov tým, že sa viaže na ich povrch a rozrušuje hydrofóbne a nekovalentné interakcie
2. unifikácia záporného náboja – molekuly SDS sa viažu na polypeptidovú kostru v konštantnom hmotnostnom pomere približne 1,4 g SDS na 1 g proteínu (čo zodpovedá asi jednej molekule SDS na každé dve aminokyseliny). Tento vysoký záporný náboj viazaného SDS úplne prekryje vlastný (natívny) náboj proteínu.
3. lineárna konformácia – všetky SDS-proteínové komplexy získavajú uniformný tyčinkovitý tvar s rovnakou hustotou záporného náboja na jednotku dĺžky. Takto nabité polypeptidové reťazce migrujú v elektrickom poli smerom ku kladne nabitej anóde (+).
4. molekulové sito gélu – polyakrylamidový gél tvorí trojrozmerné molekulové sito. Malé molekuly (peptidy a menšie proteíny) prechádzajú pórmi gélu rýchlo a ľahko, zatiaľ čo väčšie proteíny sú pórmi spomaľované.

Príprava vzorky link

Pred nanesením vzorky na gél sa roztok proteínu zmieša s nanášacím pufrom (vzorkovým pufrom, Laemmli Buffer) a podrobí sa tepelnej denaturácii.

SDS sám o sebe nedokáže redukovať kovalentné disulfidické väzby (S–S) medzi cysteínovými zvyškami. Bez ich rozštiepenia by proteíny s viacnásobnými disulfidovými mostíkmi nemohli získať úplne lineárnu konformáciu. Preto sa do nanášacieho pufru pridáva redukčné činidlo:

• β-merkaptoetanol (βME)
• ditiotreitol (DTT)

Kompletné zloženie nanášacieho roztoku je nasledovné:

• 60 mM Tris-HCl (pH 6,8) – pufruje prostredie na kyslejšiu hodnotu zodpovedajúcu zaostrovaciemu gélu
• 2 % (w/v) SDS – denaturuje proteíny a pokrýva ich záporným nábojom
• 10 % (v/v) glycerol – zvyšuje hustotu vzorky. Vďaka glycerolu vzorka po napipetovaní klesne na dno jamky pod elektródový pufor a nerozptýli sa.
• 5 % (v/v) β-merkaptoetanol (alebo DTT) – redukuje disulfidické mostíky (\( \ce{S-S -> SH + HS} \))
• 0,05 % (w/v) brómfenolová modrá – voľným okom viditeľné, nízkomolekulárne farbivo (angl. tracking dye), ktoré migruje na čele elektroforézy a naznačuje, kedy treba elektroforézu zastaviť

Zmes proteínu a vzorkového pufru sa pred nanášaním na gél inkubuje pri teplote 100 °C počas 5–10 minút (pri citlivých alebo membránových proteínoch sa niekedy používa 70 °C počas 10 minút, aby sa predišlo ich agregácii). Teplo urýchľuje denaturáciu a redukciu disulfidov.

Diskontinuálny gélový systém link

Najčastejšie sa používa diskontinuálna elektroforéza (Laemmli systém, podľa U. K. LAEMMLIHO, 1970), ktorá pozostáva z dvoch za sebou nasledujúcich gélov s rôznym pH a porezitou. Systém je v elektrickom poli orientovaný zhora nadol od katódy (–) po anódu (+):

• katóda (–)
• zaostrovací gél (4–5 %) – pH 6,8
• rozhranie gélov
• separačný gél (6–15 %) – pH 8,8
• anóda (+)

Diskontinuálnu elektroforézu tvoria dva gély:

1. zaostrovací gél (koncentračný gél, angl. stacking gel) – horný gél s nízkou koncentráciou akrylamidu a kyslejším pH 6,8
2. separačný gél (rozdeľovací gél, angl. resolving gel, separating gel) – dolný gél s vyššou koncentráciou akrylamidu a zásaditejším pH 8,8

Z funkčného hľadiska je dôležité predovšetkým samotné rozhranie gélov, kde dochádza k zakoncentrovaniu proteínovej vzorky do úzkeho priestoru, čo pomáha pri jej následnej separácii (v separačnom géli) vytvoriť vizuálne ľahšie odlíšiteľné prúžky proteínov konkrétnej veľkosti. Fyzikálny dej, ktorý toto zabezpečuje, je pomerne komplikovaný, no zohráva tu úlohu práve rozdiel v pH oboch gélov a špecifické interakcie chloridových aniónov a neutrálneho glycínu (súčasť elektroforetického pufru) so záporne nabitými proteínmi (pokrytých SDS) v elektrickom poli aparatúry.

Rozlišovacia schopnosť gélu link

Od koncentrácie separačného gélu závisí jeho rozlišovacia schopnosť, tzn. v akom rozsahu veľkostí bude možné bezpečne dané proteíny od seba odlíšiť ako samostatné prúžky. Platí pritom, že ak hľadáme proteín nejakej konkrétnej veľkosti, volíme takú koncentráciu gélu, pri ktorej je táto hodnota čo najbližšie stredu rozsahu. Tým zároveň zabezpečíme, že náš proteín bude približne v strede gélu, kde relatívne vzdialenosti medzi prúžkami veľmi dobre kopírujú rozdiely v hmotnosti daných proteínov.

Behové prostredie (Tris-glycín-SDS behový pufor) link

Elektroforéza prebieha vo vertikálnej komore naplnenej elektródovým pufrom (elektroforetickým pufrom, behovým pufrom):

• 25 mM Tris
• 192 mM glycín
• 0,1 % (w/v) SDS

Výsledné pH je približne 8,3. Behový pufor zaisťuje elektrickú vodivosť, dopĺňa zásobu SDS a udržiava stabilné pH počas celej elektroforézy.

Vizualizácia a detekcia proteínov v géli link

Proteínové prúžky nie sú počas migrácie v géli viditeľné (vidno len modré čelo brómfenolovej modrej). Po dokončení elektroforézy je potrebné proteíny v géli zviditeľniť.

Farbenie Coomassie Brilliant Blue R-250 link

Najrozšírenejšou klasikou je farbenie pomocou organického farbiva Coomassie Brilliant Blue R-250.

Farbiaci roztok link

• 50 % (v/v) metanol
• 10 % (v/v) kyselina octová
• 0,15 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250

Metanol a kyselina octová slúžia zároveň ako fixačný roztok – vyzrážajú a denaturujú proteíny v póroch gélu, čím zabránia ich difúzii a vyplaveniu. Farbiaci roztok zafarbí celý gél na tmavomodro.

Odfarbovací roztok link

Odfarbovací roztok (angl. destaining solution) pozostáva z:

• 15 % (v/v) metanol
• 10 % (v/v) kyselina octová

Odfarbovací roztok vymýva nenaviazané farbivo z polyakrylamidovej matrice gélu, zatiaľ čo farbivo naviazané na proteíny zostáva. Po niekoľkých premývaniach vznikne číry gél, v ktorom budú intenzívne modro sfarbené len proteínové prúžky.

Iné detekčné metódy link

Proteíny možno zviditeľniť (vizualizovať) aj inými metódami, ktoré sa odlišujú rôznou citlivosťou na množstvo detegovaného proteínu, príp. ich použitie rôznym spôsobom ovplyvňuje následné analýzy:

• farbenie striebrom (angl. silver staining) – založené na redukcii dusičnanu strieborného (AgNO₃) na kovové striebro. Je až 100-krát citlivejšie než farbenie Coomassie (deteguje od 1 ng proteínu).
• fluorescenčné farbenie (napríklad SYPRO Ruby) – intenzita zafarbenia priamo zodpovedá množstvu proteínu a nepoškodzuje proteíny pre ďalšie analýzy (napr. presné meranie koncentrácie a následnú identifikáciu)
• western blotting – prenos proteínov na nitrocelulózovú alebo PVDF membránu a následnú identifikáciu pomocou špecifických protilátok

Typy elektroforézy link

V drvivej väčšine prípadov sa v bežnej laboratórnej praxi pod pojmom SDS-PAGE myslí redukujúca SDS-PAGE, kde DTT alebo βME sú súčasťou vzorkového pufru. V špecifických prípadoch sa však dá použiť aj neredukujúca SDS-PAGE (bez DTT ani βME), ktorou sa môže zisťovať to, či väzba medzi proteínovými podjednotkami je kovalentného charakteru (disulfidické väzby S−S) alebo nie.

Pri natívnej PAGE, ako už názov napovedá, sa nepoužíva ani SDS a proteíny sú teda počas migrácie v géli zbalené vo svojej terciárnej štruktúre, čo sa hodí na štúdium ich biologickej a enzýmovej aktivity. Natívna PAGE pozostáva väčšinou z jedného gélu (nerobí sa osobitne zaostrovací a separačný gél) a má presne kalibrované pH ako aj pH elektroforetického roztoku.