Denaturačná elektroforéza proteínov v polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE)

SDS-PAGE (angl. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) je technika elektroforetickej separácie proteínov v polyakrylamidovom géli (množstvo akrylamid-bisakrylamidu je 6-15%) s použitím denaturačného činidla - SDS (sodium dodecyl sulfát). Používa sa na sledovanie účinnosti purifikačných postupov (je proteín očakávanej veľkosti prítomný na géli? sú prítomné kontaminujúce proteíny?). Princípom tejto techniky je separácia proteínov na základe ich veľkosti, bez ohľadu na konformáciu alebo náboj proteínu. SDS narušuje terciárnu a sekundárnu štruktúru proteínu tým, že sa viaže na jeho povrch a zároveň ho pokrýva negatívnym nábojom, takže polypeptidové reťazce migrujú v polyakrylamidovom géli ku kladne nabitej anóde. SDS je súčasťou nanášacieho tlmivého roztoku, ktorý sa pridáva do roztoku proteínu a inkubuje pri 100°C / 5-10 min.

Jediné, čo SDS nedokáže, je redukovať disulfidické väzby S-S. Do nanášacieho tlmivého roztoku sa preto pridáva redukujúce činidlo, napr. ditiotreitol (DTT) alebo beta-merkaptoetanol (βME).

Kompletné zloženie nanášacieho roztoku je nasledovné:

60 mM Tris-Cl, pH = 6,8
2% (w/v) SDS
10% (v/v) glycerol
5% (v/v) β-merkaptoetanol
0,05% brómfenolová modrá

Elektroforéza prebieha najčastejšie v Tris-glycín-SDS tlmivom roztoku:

25 mM Tris
192 mM glycín
0,1% (w/v) SDS

Samotné proteínové prúžky nie sú počas migrácie v géli viditeľné. Zviditelňujú (vizualizujú) sa najčastejšie pomocou modrej farbičky Coomassie Brilliant Blue R-250. Zloženie farbiaceho roztoku je nasledovné:

50% (v/v) metanol
10% (v/v) kyselina octová
0,15% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250

Takýto roztok zafarbí celý gél, nielen proteíny. Následne však prebytočnú farbičku vymyjeme odfarbovacím roztokom, takže po chvíli ostanú zafarbené len proteíny:

15% (v/v) metanol
10% (v/v) kyselina octová