Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC)

HPLC (angl. high-performance/pressure liquid chromatography = vysokoúčinná kvapalinová chromatografia) nie je ani tak samostatná metóda, ako zdokonalenie predchádzajúcich chromatografických techník za účelom efektívnejšej a rýchlejšej separácie analytov. V ostatných desaťročiach je hojne používaná na analytickú separáciu peptidov a proteínov, ich kvantifikáciu a charakterizáciu. Väčšie kolóny majú využitie aj pri preparatívnej separácii.

Separácia pri HPLC môže prebiehať na základe veľkosti molekúl, náboja alebo hydrofobicity. Rozlišovacia schopnosť je pri HPLC zvýšená použitím menších guličiek (silikagélovej matrice), ktoré zvyšujú efektívnu plochu separácie molekúl. Menšie guličky však tiež vytvárajú väčší spätný odpor v mobilnej fáze, ktorý je v systéme HPLC potlačený veľkým operačným tlakom, ktorý je vyvíjaný na chromatografickú kolónu. Mobilnou fázou je najčastejšie zmes rozpúšťadiel (napr. vody, acetonitrilu, metanolu), ktorá (spolu s teplotou) najviac ovplyvňuje separačný proces.

Základnými komponentami HPLC sú:

• zásobník pre rozpúšťadlo/á (mobilnú fázu) ①
• zmiešavač mobilnej fázy ② - mieša rôzne rozpúšťadlá v gradientovom pomere do jednotnej mobilnej fázy
• pumpa ③ - vytvára tlak (400-600 barov) a posúva mobilnú fázu rýchlosťou cca 1-2 ml/min
• zásobník pre roztok proteínu - z neho sa proteínová vzorka pomocou automatického alebo manuálneho injektora ④ mieša s mobilnou fázou (automatický dávkovač umožňuje navyše postupne analyzovať až 100 rôznych proteínových vzoriek)
• prepínač okruhov ⑤ - pri zapnutej polohe primiešava roztok proteínu do mobilnej fázy
• protektívna kolóna ⑥ - menšia chromatografická kolóna, ktorá zadržiava väčšie častice (>2 µm) pred vstupom do analytickej kolóny, čím udržiava nepretržitý prúd mobilnej fázy ako aj tlak v kolóne a výrazne tým zlepšuje separáciu
• analytická kolóna ⑦ - chromatografická kolóna s prebiehajúcou separáciou proteínov
• ohrievač kolóny - väčšina prístrojov pre HPLC umožňuje regulovať teplotu separácie, najmä kvôli reprodukovateľnosti separácie
• detektor ⑧ - pri výstupe z analytickej kolóny meria množstvo proteínu v čase
• mikroprocesor (počítač) ⑨ - namerané hodnoty prevádza do tzv. kvapalinového chromatogramu a umožňuje analýzu dát
• zásobník na odpad ⑩ - sem smeruje roztok po ukončení separácie a zmeraní kvantity

Ako už bolo povedané, HPLC je len nové prevedenie klasických separačných chromatografických techník, a to predovšetkým:

• chromatografia v reverznej fáze (RP-HPLC)
• chromatografia v normálnej fáze (NP-HPLC)
• ionomeničová chromatografia (IEX-HPLC)
• gélová filtrácia (SEC-HPLC)
• (imuno)afinitná chromatografia

Výhodou HPLC je rýchlosť separácie proteínov (napr. 1 hod v porovnaní s 3 dňami klasickej gélovej filtrácie pri nízkom tlaku). Tým je obmedzená aj možná difúzia proteínov a proteolýza. Vďaka automatizácii je zabezpečená vysoká reprodukovateľnosť chromatografickej separácie. Nevýhodou môže byť vyššia cena analýzy a náročnosť na technickú obsluhu. Problémom sú aj proteíny, ktoré ostanú zachytené na kolóne (nebudú detegovateľné). Vysoká rýchlosť separácie môže znižovať rozlišovaciu schopnosť niektorých zložiek zmesi.

FPLC link

Technika FPLC (angl. fast performance/protein liquid chromatography) vznikla vo Švédsku v roku 1982, špeciálne za účelom purifikácie proteínov (prístrojová rada ÄKTA od firmy GE Healthcare Life Sciences).

FPLC je modifikáciou metódy HPLC v tom zmysle, že na separáciu proteínov nepoužíva tak vysoký tlak. Zatiaľ čo analytické kolóny na FPLC pracujú pri tlaku do 5 barov a prietoku 1-5 ml/min, pri HPLC sa pracuje s mnohonásobne vyšším tlakom. Pokiaľ je však možné kontrolovať operačný tlak, FPLC kolóny môžu byť kompatibilné s HPLC prístrojmi, ale málokedy aj opačne (HPLC kolóny do FPLC prístrojov). Cieľom výrobcov je konštruovať kolóny, ktoré sú vhodné pre obidve techniky, takže pravdepodobne v budúcnosti termín FPLC zanikne.