Autor: Peter Pančík
Publikované dňa:
Citácia: PANČÍK, Peter. 2016. Biopedia.sk: Heterologická expresia proteínov. [cit. 2024-11-25]. Dostupné na internete: <https://biopedia.sk/molekularna-biologia/heterologicka-expresia-proteinov>.
Pojem heterologická expresia proteínu predstavuje cielenú produkciu (expresiu) proteínu v nejakom živom, biologickom systéme. Tento proteín je pre daný organizmus väčšinou cudzorodý (heterologický) a gén pre jeho syntézu je do neho umelo vnesený technikami molekulárnej biológie, t.j. pomocou expresného vektora (napr. plazmidovej DNA). Expresný vektor spolu s týmto organizmom tvoria ucelený expresný systém. Takéto organizmy nemôžu nikdy vzniknúť prirodzeným procesom pohlavného splynutia, ale majú charakter geneticky modifikovaných organizmov (GMO).
Heterologicky exprimovaný proteín je v týchto organizmoch spravidla produkovaný vo veľkom množstve, hovoríme že je nadprodukovaný (nadexprimovaný). Proteín v takomto množstve je vhodný pre ďalšiu analýzu štruktúry (napr. určenie priestorovej štruktúry) a funkcie. V neposlednom rade, vysoká hladina expresie niektorých proteínov, ktoré sú dôležité v medicínskej praxi, farmaceutickom alebo potravinárskom priemysle, má významný komerčný prínos.(1)(2)(3)
Príprava expresného systému link
Všeobecným postupom prípravy vhodného expresného systému je:
- výber expresného vektora a príslušného organizmu, na základe charakteru a využitia exprimovaného proteínu
- tvorba rekombinantného expresného vektora klonovaním génu, kódujúcim daný proteín, cez vybrané restrikčné miesta
- transformácia organizmu týmto vektorom
- selekcia transformantov, napr. pomocou antibiotickej rezistencie, ktorá je súčasťou expresného vektora
- selekcia klonov exprimujúcich (biologicky aktívny) rekombinantný proteín
Indukcia heterologickej expresie link
Heterologická expresia proteínu je len výnimočne konštitutívna (trvalá). V týchto experimentoch je väčšinou nutné expresný systém "predpripraviť" na produkciu proteínu (napr. namnožiť baktérie v tekutom médiu do potrebnej hustoty), pretože jeho expresia tvorí vždy záťaž pre daný organizmus. Tvorba proteínu je v určitom časovom okamihu spustená, indukovaná, pomocou nejakej jednoduchej chemickej zlúčeniny (napr. IPTG) alebo fyzikálnymi metódami (napr. zvýšenie teploty).
Aby bolo následne možné daný proteín prečistiť (purifikovať) od zvyšku biomasy (nukleové kyseliny, sacharidy, lipidy, iné proteíny), býva tento proteín často rôzne modifikovaný, t.j. nesie akúsi "biologickú" značku. Takýto proteín, ktorého sekvencia je cielene pozmenená, nazývame rekombinantný proteín. Purifikácii rekombinantných proteínov sa budem venovať v samostatnom článku.
Prehľad expresných systémov link
Neexistuje univerzálny, najlepší expresný systém pre produkciu proteínov, všetko má svoje plusy aj mínusy. Prístupy sú často značne empirické (nepredvídateľné) a individuálne pre ten-ktorý proteín. Dokonca aj v rámci jedného expresného systému existuje niekoľko variácií a optimalizácií postupu expresie rekombinantného proteínu za účelom dosiahnutia stanoveného výťažku (množstva proteínu). Čo je však častokrát dôležitejšie ako samotný výťažok, je zachovanie biologickej aktivity študovaného rekombinantného proteínu.
Biologické expresné systémy rozdeľujeme na 2 základné typy podľa charakteru produkčného organizmu:
- prokaryotické expresné systémy - rôzne bakteriálne expresné systémy, napr. Escherichia coli, Bacillus spp.
- eukaryotické expresné systémy - pôvodom eukaryotické systémy (napr. kvasinky, cicavčie bunky), alebo eukaryotické bunky infikované rekombinantnými vírusmi alebo baktériami, ako nositeľmi cudzorodej DNA (hmyzie bunky a bakulovírusový expresný systém, rastlinné bunky a baktéria Agrobacterium tumefaciens)
Bakteriálne expresné systémy link
Baktérie sú veľmi vhodným producentom proteínov z viacerých dôvodov:
- rýchle množenie, resp. krátka generačná doba
- jednoduchá transformácia, najčastejšie rekombinantným plazmidom
- technicky a finančne nenáročné na kultiváciu
- produkcia veľkého množstva proteínu (mg až g / liter kultivačného média)
Napriek uvedeným výhodám sú prokaryotické expresné systémy nevhodné pre produkciu niektorých proteínov. Sú to nevýhody plynúce z rozdielnej proteosyntetickej mašinérie, ktorou sa odlišujú prokaryotické organizmy od organizmov eukaryotických. Z toho dôvodu je najmä produkcia proteínov "eukaryotického pôvodu" v baktériách nie vždy úspešná. Mnohé z nevýhod sa však dajú prekonať.
| problémy so stabilitou expresného plazmidu (rekombinácie) |
| použitie bakteriálneho kmeňa defektného na enzýmy zabezpečujúce rekombináciu DNA |
| absencia posttranskripčných modifikácií - vyštepovania (excízie) intrónov z mRNA |
| modifikácia sekvencie polypeptidu na úrovni rekombinantného plazmidu (zaradenie len exónov do čítacieho rámca - reverzný prepis mRNA do cDNA) |
| odlišná populácia tRNA (bakteriálne tRNA rozoznávajú predovšetkým časté "bakteriálne" kodóny v mRNA, ale len malé percento tRNA rozoznáva niektoré často používané "eukaryotické" kodóny, čo môže spôsobovať mutácie na úrovni translácie) |
| použitie bakteriálneho kmeňa nesúceho dodatočný plazmid s doplnkovými tRNA rozoznávajúcimi "eukaryotické" kodóny (napr. E. coli Rosetta (DE3)) |
| špecifiká prokaryotickej iniciácie translácie |
| nutná je prítomnosť Shine-Dalgarnovej sekvencie (býva súčasťou expresného vektora) pre úspešnú inicializáciu translácie na prokaryotickom ribozóme dôležitá je aj optimálna vzdialenosť od Shine-Dalgarnovej sekvencie po ŠTART kodón, ktorý kóduje prvú aminokyselinu - metionín overiť sekvenovaním rekombinantného plazmidu, či nevzniká posunová (frameshift) mutácia v čítacom rámci rekombinantného proteínu |
| problémy so skladaním (foldingom) proteínov (1) vplyvom rýchlej nadexpresie proteínu |
| úprava kultivačných podmienok (napr. nižšia kultivačná teplota, médium chudobnejšie na živiny), ktoré spomalia bakteriálnu transláciu a podporia správny folding nižšia koncentrácia indukčného činidla (IPTG) znižuje hladinu expresie nízkokópiový rekombinantný vektor taktiež znižuje mieru heterologickej expresie, na rozdiel od vektorov, ktoré sa nachádzajú v bunke v mnohých kópiách (efekt génovej dózy/dávky) použitie menej "efektívneho" expresného systému ("slabší" promótor T7-polymerázy alebo iná RNA-polymeráza) súčasná expresia (koexpresia) pomocných proteínov, tzv. chaperónov, ktoré napomáhajú foldingu rekombinantného proteínu alebo rozlišujú a degradujú nesprávne poskladané molekuly |
| problémy so skladaním (foldingom) proteínov (2) vplyvom neschopnosti tvoriť disulfidické väzby v redukujúcej cytoplazme niektorých baktérií (E. coli) |
| zmena lokalizácie exprimovaného proteínu, napr. produkcia do periplazmy alebo kultivačného média (namiesto cytoplazmy) použitie bakteriálneho kmeňa s defektom enzýmov spôsobujúcich redukujúce prostredie v cytoplazme (napr. E. coli Origami (DE3)) |
| toxicita cudzorodého proteínu pre baktérie |
| v prípade toxického proteínu sa používajú kmene s označením pLysS, ktoré inhibujú bazálnu aktivitu T7-polymerázy ešte pred cielenou indukciou expresie rekombinantného proteínu použiť hostiteľský organizmus, ktorý prirodzene exprimuje rekombinantný proteín do mimobunkového prostredia (napr. Bacillus spp.) |
| problémy so stabilitou, resp. degradáciou rekombinantného proteínu |
| splynutie (fúzia) malých (menej ako 80 aminokyselín) alebo málo rozpustných (solubilných) proteínov s nejakým prirodzene solubilným proteínom (napr. glutation-S-transferáza - GST) zvyšuje solubilitu ako aj stabilitu rekombinantného proteínu mnohé kmene sú defektné v proteázach (enzýmoch degradujúcich cudzie proteíny) |
| absencia posttranslačných modifikácií (glykozylácie a pod.) |
| býva najčastejším dôvodom pre výber niektorého z eukaryotických expresných systémov |
Inklúzne telieska link
Ak je produkcia rekombinantného proteínu príliš rýchla alebo dochádza k nesprávnemu foldingu proteínu z iného dôvodu, polypeptidové reťazce sa hromadia v cytoplazme baktérií a tvoria tzv. inklúzne telieska. Inklúzne telieska tak predstavujú nerozpustné (nesolubilné) zhluky rekombinantného proteínu, ktoré sú väčšinou (ale nie vždy) biologicky neaktívne. Naproti tomu výhodou tvorby inklúznych teliesok je:
- ochrana pred proteolytickým štiepením bunkovými proteázami (enzýmy degradujúce proteíny)
- jednoduchá purifikácia inklúznych teliesok centrifugáciou
- vysoká koncentrácia a čistota rekombinantného proteínu v inklúznych telieskach
Proteín z inklúznych teliesok možno solubilizovať - denaturovať použitím chaotropných činidiel (močovina, guanidín-hydrochlorid), silných aniónových detergentov (napr. sodium-dodecyl-sulfát - SDS) alebo organickými rozpúšťadlami a znovu ho "poskladať" - renaturovať s vhodným tlmivým roztokom (pufrom), ktorého zloženie je značne individuálne v závislosti od konkrétneho rekombinantného proteínu. Odstránenie denaturačného činidla spravidla prebieha dialýzou.
Heterologická expresia proteínov v E. coli link
Escherichia coli je prokaryotická gram-negatívna baktéria, ktorá sa často používa na heterologickú expresiu rekombinantných proteínov s cieľom výskumu a často aj komerčnej produkcie terapeutických proteínov. V závislosti od podmienok kultivácie dokážu bunky E. coli exprimovať veľké množstvo heterológneho rekombinantného proteínu (v mg až g / liter kultivačného média) už v priebehu niekoľkých hodín. Okrem toho, ich kultivácia nevyžaduje žiadne špeciálne požiadavky na zloženie kultivačných médií; z bežných zdrojov uhlíka (glukóza alebo glycerol), dusíka (NH4Cl) a iných biogénnych prvkov v podobe anorganických zlúčenín (Na2HPO4, KH2PO4, NaCl, MgSO4, CaCl2) dokážu syntetizovať všetky aminokyseliny a rásť bez obmedzenia.
E. coli je veľmi vhodná na prípravu proteínov, alebo ich častí, ktoré sa majú použiť na tvorbu protilátok. V tejto baktérii sa tiež môžu rýchlo produkovať veľké množstvá antigénu, dokonca aj keď nadprodukovaný proteín nemusí byť správne poskladaný.
Expresný systém pET link
Expresný systém pET je účinný systém pre heterologickú produkciu rekombinantných proteínov v Escherichia coli, ktorý komercionalizovala firma Novagen.(4) Ponúka širokú škálu plazmidových expresných vektorov s označením pET-xya-c (napr. pET-26b) a bakteriálnych kmeňov. Plazmidy sa odlišujú najmä:
- rôznym selekčným markerom (antibiotiková rezistencia na ampicilín alebo kanamycín)
- sekvenciami, kódujúcimi proteínové kotvy (tzv. proteínové prívesky, proteínové tagy), ktoré umožňujú purifikáciu rekombinantného proteínu
- pripojením tejto kotvy na C- alebo N-terminálny koniec proteínu
- prítomnosťou špeciálnych sekvencií, ktoré rozoznávajú miestne-špecifické proteázy (poskytujú možnosť odštiepiť proteínovú kotvu po purifikácii rekombinantného proteínu od zvyšku proteínu, ktorý nás zaujíma)
Okrem toho je súčasťou každého expresného plazmidu pET:
- počiatok replikácie (ori)
- T7-promótor, ktorý môže, ale nemusí obsahovať operátor pre väzbu s lacI represorom
- Shine-Dalgarnova sekvencia, potrebná pre iniciáciu translácie
- polylinker - oblasť pre inzerciu génu rekombinantného proteínu, ktorý chceme exprimovať
- lacI represor - nie je nevyhnutný, ak už bakteriálny chromozóm obsahuje kópiu lacI génu
Tento expresný systém využíva geneticky modifikované bakteriálne kmene, ktoré nesú na bakteriálnom chromozóme regulačné gény laktózového operónu, a to lac promótor s lacO operátorom a lacI represor. Za lac promótor je vložený gén pre T7-polymerázu. T7-polymeráza je RNA-polymeráza derivovaná z bakteriofágu T7, ktorá s veľkou efektivitou (asi 5-krát rýchlejšie ako bakteriálna RNA-polymeráza II) a špecificitou prepisuje gény s príslušným T7-promótorom. Gén pre syntézu rekombinantného heterologického proteínu sa nachádza práve za takýmto T7-promótorom a je súčasťou expresného plazmidu.
IPTG (izopropyl-β-D-tiogalaktopyranozid) je analóg laktózy, ktorý pôsobí ako induktor laktózového operónu, podobne ako laktóza, s tým rozdielom, že ho baktérie nevedia metabolizovať, a teda nedochádza k jeho spotrebovaniu a "vyhasnutiu" efektu indukcie. Samozrejme, IPTG, v našom prípade, nespúšťa expresiu génov laktózového operónu, ale reguluje expresiu enzýmu T7-polymerázy.
IPTG spôsobuje vyviazanie lacI represora z operátoru génu pre T7-polymerázu (na obrázku). T7-gén sa prepisuje bunkovou RNA-polymerázou. T7-polymeráza potom vedie k prepisu génu nášho rekombinantného proteínu z expresného plazmidu.
Ďalšie bakteriálne expresné systémy link
Druhým najviac používaným bakteriálnym expresným systémom sú bacily – Bacillus megaterium a B. subtilis. Sú to gram-pozitívne baktérie v tvare paličiek, ktorých výhoda spočíva v prirodzenej expresii rekombinantných proteínov do mimobunkového (extracelulárneho) média a väčšej stabilite rekombinantných expresných plazmidov. Rekombinantné proteíny sekretované B. brevis sú stabilnejšie kvôli veľmi nízkej hladine prítomných proteáz a väčšinou sú dobre "poskladané" a biologicky aktívne.
Eukaryotické expresné systémy link
V prípade potreby ďalšej posttranslačnej modifikácie rekombinantných proteínov (N- alebo O-glykozylácia, hydroxylácia, myristylácia, palmitácia a pod.) je potrebné vybrať vhodný eukaryotický expresný systém, pričom najviac využívané sú kvasinky a bakulovírusové expresné systémy s hmyzími bunkami. Zo živočíšnych expresných systémov sa ďalej využívajú bunkové kultúry cicavčích buniek (napr. bunky BHK, CHO), takže nejde v pravom slova zmysle o heterologickú expresiu v živočíchoch ako takých.
Môžeme sa stretnúť aj s rastlinnými expresnými systémami, ale aj v tomto prípade sa skôr jedná o kombinovanú, a to bakteriálno-eukaryotickú expresiu, keďže ako expresný vektor sa používa Ti plazmid rekombinantnej baktérie Agrobacterium tumefaciens. V konečnom dôsledku však ide o eukaryotický expresný systém, pretože producentom proteínu sú rastlinné bunky, nie samotná baktéria.
Kvasinkové expresné systémy link
Najprv sa na heterologickú expresiu využíval druh Saccharomyces cerevisiae. Keďže samotná kvasinka sa hojne využíva v potravinárstve, všeobecne je heterologická expresia rekombinantných proteínov v tomto druhu považovaná za bezpečnú. To neplatí napr. v prípade niektorých cicavčích buniek, ktoré môžu exprimovať problematické onkogény alebo dokonca niektoré vírusy. V niektorých prípadoch sa môže hodiť expresia v kvasinke Schizosaccharomyces pombe.
Vyššie výťažky rekombinantného proteínu (až 12 g / 1 liter kultivačného média) umožňuje dosiahnuť expresia v Pichia pastoris. P. pastoris dokáže využiť ako zdroj uhlíka metanol, pričom metanolom indukovaná prirodzená expresia enzýmu alkohol-oxidázy a dihydroacetón-syntázy spôsobuje, že až 30% biomasy tvoria práve tieto enzýmy. Rekombinantné systémy P. pastoris využívajú práve tieto metanol-responzívne elementy (AOX) na heterologickú expresiu proteínov.
Bakulovírusový expresný systém link
Bakulovírusy sú lytické, veľké (130 kbp) dsDNA vírusy, z ktorých sa na heterologickú expresiu proteínov využíva hlavne rekombinantný druh Autographa californica. Rekombinantné bakulovírusy sa množia v hmyzích bunkových líniách derivovaných z druhu motýľa Spodoptera frugiperda (Sf-9, Sf-21) alebo Trichoplusia ni (High-Five). Žiadne bakulovírusy nie sú schopné infikovať ľudí.
Technika prípravy tohto systému spočíva v kotransfekcii bakulovírusovej DNA spolu s rekombinačnou kazetou s génom rekombinantného proteínu do kultúry hmyzích buniek a selekcii plakov s rekombinantným fenotypom. Tento zdĺhavý postup bol skrátený pomocou miestne-špecifickej transpozície so 100% úspešnosťou rekombinácie a bol skomercionalizovaný (Bac-to-Bac, BaculoDirect, flashBAC). Expresia rekombinantných proteínov je cytoplazmatická alebo, po pripojení signálnej sekvencie, mimobunková (extracelulárna). Pre účely správnej glykozylácie proteínov sa používajú transgénne hmyzie bunky Sf-9, ktoré pripájajú cukorný zvyšok cicavčieho typu, namiesto hmyzieho.
- Pančík P.: M3 proteín Myšieho herpetického vírusu, nový modulátor imunitnej odpovede. (2013). Virologický ústav Slovenskej akadémie vied, Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava. Dizertačná práca.
- Stuchlík S.: Heterologická expresia génov. (2012). Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava.
- Rai M., Padh H.: Expression systems for production of heterologus proteins. (2001). Current Science, vol. 80, no. 9.
- pET System Manual (2006). 11th Edition. Novagen.
