Translácia

Translácia predstavuje konečný proces realizácie genetickej informácie štruktúrnych génov. Prebieha na ribozómoch v cytoplazme alebo na membránach endoplazmatického retikula za účasti transferových RNA (tRNA), ktoré do ribozómov prinášajú jednotlivé aminokyseliny.

Na ribozómoch, ktoré sú akýmisi miniatúrnymi továrňami na výrobu bielkovín, prebieha polymerizácia aminokyselín do súvislého polypeptidového reťazca na základe genetického kódu. Keďže translácia priamo súvisí so syntézou proteínov, nazýva sa tento proces proteosyntéza.

Ako už bolo povedané, translácie sa zúčastňujú aj transferové a ribozómové RNA, ktorých štruktúru a význam treba pred opisom samotného priebehu translácie najskôr vysvetliť.

Štruktúra a význam tRNA link

Transferové RNA sú typom funkčných RNA, ktoré slúžia na prepravu, alebo transfer (odtiaľ ich názov), jednotlivých aminokyselín do ribozómu, kde sa z nich tvorí súvislý polypeptidový reťazec. Každá tRNA predstavuje jednovláknovú RNA dlhú 75–93 báz, ktorá okrem typických RNA nukleotidov obsahuje aj neobvyklé nukleotidy (napr. dihydrouracil, pseudouridín, inozín). Tie vznikajú cielenou enzymatickou posttranskripčnou modifikáciou štandardných nukleotidov.

Sekundárna štruktúra tRNA pripomína v rovine „ďatelinový štvorlístok“. Jednotlivé „lístky“ sú zložené z tzv. palindrómov. Palindrómy sú také nukleotidové sekvencie (RNA alebo DNA), ktoré sú symetrické tak, že bázy od osi symetrie smerom doľava sú komplementárne k bázam nachádzajúcim sa vpravo od osi symetrie (napr. 5'-CAGT|ACTG-3'). To spôsobuje na jednovláknovej molekule tvorbu vnútromolekulových spojení, ktoré lokálne tvoria dvojvláknový úsek nazývaný vlásenka (angl. hairpin). Ak sa v strede palindrómu nachádzajú nukleotidy, ktoré sa nevedia takýmto spôsobom popárovať, na konci vlásenky sa tvorí jednovláknová nespárovaná slučka (angl. loop).

Takýmto prípadom vlásenky so slučkou (angl. hairpin loop) sú aj samotné „lístky“ tRNA, ktoré sa odborne označujú ako ramená:

• akceptorové rameno – na jeho koniec sa kovalentne viaže aminokyselina. Na 5'-konci sa zvyčajne nachádza guanín. Prečnievajúci 3'-koniec je vždy zakončený sekvenciou CCA a práve na jeho posledný adenín sa viaže prenášaná aminokyselina.
• antikodónové rameno s antikodónovou slučkou – nesie trojicu báz (antikodón), ktorou tRNA na princípe komplementarity rozoznáva genetický kód „zapísaný“ v mRNA. Prítomnosť minoritnej bázy inozín na tomto mieste umožňuje tzv. teóriu kolísania (wobble hypothesis) – flexibilné párovanie báz, vďaka ktorému môže jedna tRNA rozpoznať viacero rôznych kodónov pre tú istú aminokyselinu.
• pseudouridínové rameno s TΨC-slučkou – obsahuje modifikovaný uracil – pseudouracil
• dihydrouridínové rameno s D-slučkou – obsahuje modifikovaný uracil – dihydrouracil
• variabilná slučka – môže byť krátka (tRNA typu I) alebo dlhá (tRNA typu II), má premenlivú dĺžku a neovplyvňuje biologickú funkciu tRNA

Obidva konce RNA (3' aj 5') sa nachádzajú v akceptorovom ramene tRNA. Na každú tRNA sa pripája len jedna aminokyselina. Spájanie aminokyseliny s príslušnou tRNA je prísne špecifické a vyžaduje dodanie energie. Pre každú z 20 proteínogénnych (tvoriacich proteíny) aminokyselín existuje osobitný enzým – aminoacyl-tRNA-syntetáza. Tento enzým najprv za spotreby ATP aminokyselinu aktivuje (vzniká aminoacyl-adenylát) a následne vytvára kovalentnú väzbu medzi tRNA a jej príslušnou aminokyselinou. K tomuto procesu dochádza voľne v cytoplazme (a vo vnútri semiautonómnych organel) ešte pred samotným transportom tRNA na ribozóm.

Rovnaké aminokyseliny môžu byť spájané s rôznymi tRNA, ale rovnaké tRNA viažu len jednu špecifickú aminokyselinu, čo priamo súvisí s tzv. degenerovanosťou genetického kódu a teóriou kolísania. Všetky tRNA nadobúdajú v živom systéme podobnú terciárnu štruktúru v tvare písmena „L“ (alebo obráteného „Γ“), ktorou najlepšie pasujú do vstupných miest (katalytických centier) na ribozóme. Vnútromolekulové interakcie (vlásenky) v tRNA však zostávajú zachované aj počas tohto priestorového usporiadania.

Genetický kód link

Zaradenie aminokyseliny do polypeptidového reťazca je dané pomocou troch za sebou idúcich nukleotidov na mRNA. Takáto trojica nukleotidov sa nazýva kodón. Genetický kód je teda systém pravidiel, podľa ktorých sekvencia nukleotidov určuje zaradenie štandardných aminokyselín do rastúceho proteínu. Za jeho rozlúštenie dostal MARSHALL NIRENBERG (1927–2010) v roku 1968 Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu.

Ku kodónom na mRNA sú komplementárne tzv. antikodóny nachádzajúce sa na antikodónovom ramene tRNA. Čítanie genetického kódu teda znamená vzájomné rozpoznávanie kodónov a antikodónov na ribozóme počas proteosyntézy. O tripletoch sa hovorí aj na úrovni DNA, tu si však treba dať pozor na terminológiu vlákien. Molekula mRNA vzniká prepisom z templátového (matricového) vlákna DNA, ktoré je orientované 3'–5'. Druhé vlákno DNA (5'–3') sa nazýva kódujúce (sense), pretože jeho sekvencia je identická s výslednou mRNA (líši sa len prítomnosťou tymínu namiesto uracilu).

Ak je teda na mRNA štart kodón 5'-AUG-3' (kódujúci metionín), zodpovedajúci triplet na templátovom vlákne DNA je 3'-TAC-5' a na kódujúcom vlákne 5'-ATG-3'. Keďže toto 5'–3' vlákno na DNA nie je predmetom prepisu RNA-polymerázou, nemali by sme tvrdiť, že „triplet ATG kóduje metionín“.

Genetický kód pozostáva celkovo zo 64 kodónov (4³ = 64). Zmysel kodónu je jeho schopnosť kódovať aminokyselinu, pričom 61 kodónov má zmysel. Niektoré kodóny nekódujú žiadnu aminokyselinu, ale majú signalizačnú funkciu (tzv. nezmyselné kodóny). Signalizácia určuje presný začiatok a koniec syntézy polypeptidového reťazca, pretože nie celá dlhá molekula mRNA je prekladaná do proteínu. Úsek na mRNA, ktorý obsahuje úplnú informáciu pre syntézu polypeptidu, sa nazýva otvorený čítací rámec (angl. open reading frame – ORF).

• Začiatok syntézy je určený iniciačným (START) kodónom AUG. Ten nielen signalizuje začiatok, ale kóduje aj aminokyselinu metionín (má teda aj zmysel).
• Koniec syntézy polypeptidu signalizuje jeden z troch terminačných (STOP) kodónov: UAA, UAG alebo UGA, ktoré nekódujú žiadnu aminokyselinu.

Znamená to, že kodónov, ktoré skutočne kódujú aminokyseliny, je len 61. Keďže proteinogénnych aminokyselín je 20, vyplýva z toho, že väčšina aminokyselín je kódovaná viacerými rôznymi kodónmi (tzv. synonymnými kodónmi). To je umožnené existenciou rôznych tRNA, ktoré nesú rovnakú aminokyselinu, ale majú odlišné antikodóny. Táto vlastnosť genetického kódu sa nazýva degenerovanosť (zmnoženosť).

V tabuľke genetického kódu sa kodóny pre tú istú aminokyselinu často odlišujú len v tretej pozícii nukleotidu. Ak zmena 3. nukleotidu nezmení zmysel (aminokyselinu), takáto štvorica sa nazýva kodónová rodina. Ak majú dva synonymné kodóny na 3. pozícii len rovnaký typ bázy (purín A/G alebo pyrimidín U/C), tvoria dvojkodónovú sadu.

Za určitých špecifických okolností môže STOP kodón UAG a UGA slúžiť na zaradenie neštandardnej 21. a 22. aminokyseliny, akými sú pyrolyzín a selenocysteín.

Genetický kód je teda:

• tripletový
• neprekrývajúci sa a nepretržitý
• jednoznačný (nedvojzmyselný)
• univerzálny
• degenerovaný

Štruktúra a funkcia ribozómov link

Ribozómy sú submikroskopické, membránou neohraničené organely, ktoré slúžia ako miesta syntézy proteínov (translácie) v cytoplazme každej prokaryotickej a eukaryotickej bunky. V priemere majú ~20 nm a skladajú sa zo 65 % ribozomálnej RNA (rRNA) a 35 % ribozomálnych proteínov. Sú to teda zložité ribonukleoproteínové komplexy. V pokoji existujú vo forme dvoch oddelených podjednotiek, ktoré sa spájajú výlučne len počas samotnej proteosyntézy.

Prokaryotické a eukaryotické ribozómy sa od seba presne štruktúrne líšia vo veľkosti a zložení. Mierou ich hmotnosti a veľkosti je tzv. sedimentačný koeficient (udáva sa v jednotkách Svedberg – S), ktorý určuje rýchlosť sedimentácie týchto častíc pri ultracentrifugácii.

• Prokaryotické ribozómy (70S) – skladajú sa z malej (30S) a veľkej (50S) podjednotky. Sú tvorené 3 typmi rRNA (16S, 23S, 5S) a 52 bielkovinami. Nachádzajú sa voľne v cytoplazme baktérií, ale na základe endosymbiotickej teórie aj v mitochondriách a chloroplastoch eukaryotov.
• Eukaryotické ribozómy (80S) – sú väčšie, skladajú sa z malej (40S) a veľkej (60S) podjednotky. Obsahujú 4 typy rRNA (18S, 28S, 5,8S a 5S) a 82 bielkovín. Tieto podjednotky sa formujú priamo v jadierku (v oblasti nukleolárneho organizátora) a do cytoplazmy prechádzajú cez jadrové póry.

V eukaryotickej bunke sa ribozómy vyskytujú v dvoch formách:

• voľné ribozómy – lokalizované v cytoplazme, syntetizujú proteíny určené pre vlastnú (endogénnu) potrebu bunky
• viazané ribozómy – pripojené na drsné endoplazmatické retikulum (ER). Tieto ribozómy syntetizujú sekrečné (exportné) proteíny alebo glykoproteíny. O tom, či sa ribozóm pripojí na ER, rozhoduje tzv. signálna sekvencia na samom začiatku vznikajúceho polypeptidu. Táto sekvencia rozpozná špecifický receptor na membráne ER, celý komplex sa tam ukotví a polypeptid sa dosyntetizuje priamo dovnútra cisterien.

Ultraštruktúra a funkčné miesta link

Na plne spojenom, aktívnom ribozóme sa definujú presné funkčné miesta pre interakciu s molekulami mRNA a tRNA:

• väzbové miesto pre mRNA – je umiestnené výlučne na malej podjednotke
• A-miesto (aminoacylové) – sem vstupujú nové tRNA nesúce príslušnú aminokyselinu
• P-miesto (peptidylové) – v tomto mieste prebieha predlžovanie polypeptidového reťazca o ďalšiu aminokyselinu. U prokaryotov sem priamo vstupuje iniciačná tRNA.
• peptidyltransferázové centrum – samotné miesto enzymatickej tvorby peptidovej väzby. Je integrálnou súčasťou veľkej podjednotky.
• E-miesto (výstupné / exit) – tRNA, ktorá už odovzdala svoju aminokyselinu reťazcu, je z tohto miesta uvoľnená z ribozómu preč
• miesta pre translačné faktory – miesta na viazanie pomocných proteínov, ktoré urýchľujú a regulujú proteosyntézu

Všeobecný priebeh translácie link

Podobne ako replikácia a transkripcia, aj translácia prebieha v troch základných fázach a vyžaduje si množstvo asistenčných proteínov a energiu vo forme GTP:

1. iniciácia
2. elongácia
3. terminácia

Iniciácia translácie link

Iniciácia začína spojením malej ribozómovej podjednotky, mRNA a iniciačnej tRNA. Tento proces riadia iniciačné faktory za spotreby GTP. U prokaryotov sa malá podjednotka viaže na mRNA pomocou tzv. Shine-Dalgarnovej sekvencie a prvá tRNA prináša modifikovaný formylmetionín. U eukaryotov ribozóm rozpoznáva 5'-čiapočku na mRNA a iniciačná tRNA prináša štandardný metionín. Iniciačná tRNA vstúpi priamo do P-miesta na ribozóme, čím sa zámerne preskočí A-miesto. Následne sa uvoľnia iniciačné faktory a k malej podjednotke sa pripojí veľká.

Elongácia translácie link

Genetický kód na mRNA sa číta postupne po tripletoch v trojkrokovom cykle. Nová aminoacyl-tRNA vstupuje do voľného A-miesta (transportovaná špecifickým elongačným faktorom). Ak sa antikodón prichádzajúcej tRNA správne komplementárne spáruje s kodónom na mRNA, enzým peptidyltransferáza vytvorí peptidovú väzbu medzi novou aminokyselinou a rastúcim reťazcom. Ďalší elongačný faktor (za hydrolýzy GTP) posunie ribozóm po mRNA presne o jeden kodón, čo sa nazýva translokácia ribozómu. Tým sa prázdna deacylovaná tRNA presunie do E-miesta, odkiaľ vypadne, zatiaľ čo tRNA s narasteným peptidom sa posunie do P-miesta. A-miesto sa tým opäť uvoľní pre ďalšiu aminokyselinu.

Terminácia translácie link

Syntéza proteínu sa končí, keď ribozóm narazí v A-mieste na jeden z terminačných (STOP) kodónov (UAA, UAG, UGA). K týmto kodónom neexistujú komplementárne tRNA. Namiesto nich vstúpia do A-miesta uvoľňovacie terminačné faktory (tzv. RF faktory), ktoré svojou 3D štruktúrou imitujú tvar tRNA (fenomén známy ako molekulárne mimikry). Ich naviazanie vyvolá hydrolýzu väzby medzi poslednou tRNA a polypeptidovým reťazcom. Hotový proteín sa uvoľní a ribozóm sa rozpadne späť na voľné podjednotky.

Vzniknutý primárny polypeptid prechádza do ER a následne do Golgiho aparátu, kde podstupuje mnohé posttranslačné úpravy, aby nadobudol svoju funkčnosť. Môže ísť o chemické úpravy, tvorbu disulfidických mostíkov alebo odštiepenie častí peptidu (klasickým príkladom je vznik funkčného inzulínu z proinzulínu odštiepením C-peptidu). Finálne sa proteín priestorovo zvinie do terciárnej štruktúry.

Prokaryotická translácia link

U baktérie Escherichia coli prebieha syntéza polypeptidového reťazca obdivuhodnou rýchlosťou 10–20 aminokyselín za sekundu. Keďže baktérie nemajú jadro, transkripcia a translácia sú priestorovo a časovo spriahnuté. Kľúčovým signálom pre správne nasadnutie malej (30S) ribozómovej podjednotky je už spomínaná Shine-Dalgarnova sekvencia (5'-AGGA-3'), ktorá je priamo komplementárna k 3'-koncu 16S-rRNA na malej podjednotke. Vďaka tomu môže byť jedna mRNA okamžite pokrytá a prekladaná mnohými ribozómami naraz (vzniká tzv. polyzóm).

Typickým znakom bakteriálnej translácie je, že ako prvá aminokyselina sa vždy zaraďuje chemicky modifikovaný formylmetionín. Špeciálna iniciačná tRNA nesúca formylmetionín je rozpoznaná iniciačným faktorom IF2 a vložená presne na START kodón. Všetky iniciačné faktory (IF1 až IF3) sa u prokaryot viažu len s voľnou malou podjednotkou.

Ak sa kodón AUG objaví neskôr vo vnútri sekvencie, už ho nerozpoznáva iniciačná tRNA, ale štandardná tRNA pre metionín za asistencie elongačného faktora EF-Tu a vstupuje normálne do A-miesta. Translokáciu ribozómu následne poháňa elongačný faktor EF-G. Termináciu napokon riadia terminačné faktory RF1 až RF3.

Eukaryotická translácia link

U eukaryot je translácia striktne oddelená od transkripcie časovo aj priestorovo (transkripcia v jadre, translácia v cytoplazme na 80S ribozómoch). Eukaryotickej mRNA úplne chýba Shine-Dalgarnova sekvencia. Hlavným rozlišovacím prvkom pre nasadnutie ribozómu je v tomto prípade modifikovaný 5'-koniec mRNA (čiapočka), ktorý je rozoznávaný zložitým aparátom eukaryotických iniciačných faktorov.

Po vytvorení komplexu malej podjednotky a iniciačnej tRNA (ktorá tu nesie vždy klasický nemodifikovaný metionín) sa tento komplex posúva (skenuje) po reťazci mRNA od 5'-konca, kým nenarazí na prvý iniciačný kodón AUG (tzv. scanning model). Tento zložitejší spôsob hľadania súvisí s tým, že AUG kodón môže byť od 5'-konca veľmi vzdialený.

Samotná elongácia a terminácia následne prebiehajú na veľmi podobnom princípe (v trojkrokovom cykle) ako u prokaryot, líši sa len názvami faktorov (napr. elongačný faktor EF1 pre vstup tRNA do A-miesta a EF2 pre translokáciu).