Objav štruktúry DNA (JAMES WATSON a FRANCIS CRICK, 1953) naznačil tzv. semikonzervatívny model jej replikácie. Pri tomto procese sa dvojzávitnica rozpletie a každé z pôvodných (materských) vlákien slúži ako matrica (templát) pre syntézu nového vlákna na princípe komplementarity báz. Výsledná molekula DNA sa tak vždy skladá z jedného pôvodného a jedného novosyntetizovaného vlákna. Celý proces katalyzuje komplex enzýmov, z ktorých najdôležitejšia je DNA-polymeráza.
Všeobecný priebeh replikácie link
Priebeh replikácie možno rozdeliť do troch fáz, ktoré sú u prokaryot a eukaryot v princípe rovnaké:
Iniciácia replikácie link
Replikácia začína v špecifickom mieste (tzv. začiatok replikácie alebo ori), kde enzým helikáza rozpletie dvojzávitnicu DNA rozrušením vodíkových väzieb. Vzniká tak tzv. replikačná vidlica. Aby sa obnažené vlákna opäť nespojili, dočasne ich stabilizujú špeciálne SSB proteíny.
Elongácia replikácie link
Enzým primáza nasyntetizuje na matricu krátky úsek RNA, tzv. primer (čítaj „prajmer“), ktorý je nevyhnutný na to, aby sa DNA-polymeráza mala o čo „ukotviť“. Keďže DNA-polymeráza dokáže predlžovať reťazec výlučne v smere 5'–3', syntéza na oboch vláknach prebieha odlišne (hovoríme o semidiskontinuálnej syntéze):
- na matrici orientovanej 3'–5' sa syntetizuje vedúci reťazec (angl. leading strand) nepretržite (kontinuálne). Na jeho syntézu postačuje jediný úvodný RNA primer.
- na opačnej matrici orientovanej 5'–3' sa syntetizuje zaostávajúci reťazec (angl. lagging strand) prerušovane (diskontinuálne). Primáza tu musí tvoriť RNA primery opakovane a DNA-polymeráza úseky predlžuje po tzv. Okazakiho fragmentoch (ktoré rastú vždy v smere 5'–3').
Krátko po syntéze Okazakiho fragmentov sú RNA primery z reťazca odstránené a nahradené DNA nukleotidmi (pomocou iného typu DNA-polymerázy). Vzniknuté medzery medzi fragmentami nakoniec pevne spojí do súvislého vlákna enzým DNA-ligáza vytvorením fosfodiesterových väzieb.
Terminácia replikácie link
Replikácia DNA sa končí vtedy, keď je zreplikovaná celá molekula. V prípade kruhovej prokaryotickej DNA terminácia nastáva, keď sa dve protichodné replikačné vidlice stretnú a spoja. U eukaryotických organizmov s lineárnymi chromozómami nastáva pri ukončovaní syntézy problém s replikáciou koncov zaostávajúceho reťazca (telomér), ktorý nedokážu klasické polymerázy doreplikovať. Preto túto úlohu preberá špecifický enzým telomeráza.
Po ukončení syntézy dochádza k vyviazaniu enzýmov a ukončeniu polymerizácie. Všetky popísané procesy prebiehajú v bunke prirodzene. Niektoré z týchto enzýmov využívame aj umelo pri tvorbe rekombinantných DNA molekúl: napr. pri PCR reakcii používame špeciálne upravenú termostabilnú DNA-polymerázu a primery, pomocou ktorých replikujeme cielené úseky DNA; pri klonovaní zas využívame na spájanie vektora s inzertom upravenú DNA-ligázu.
Úloha DNA-polymeráz link
Existuje viacero druhov DNA-polymeráz, všetky však pripájajú deoxyribonukleozid-5'-monofosfáty (skrátene dNMP) k voľnému 3'-OH koncu syntetizovaného reťazca podľa komplementarity báz na matricovom (templátovom) reťazci. Ako substrát vyžadujú RNA alebo DNA primer, voľné deoxyribonukleozid-5'-trifosfáty (dNTP) a ióny Mg²⁺.
Všetky predlžujú dcérsky reťazec v smere 5'–3', t. j. majú 5',3'-polymerázovú aktivitu. Niektoré sa vyznačujú aj exonukleázovou aktivitou, t. j. odstraňujú nukleotidy prítomné na dcérskom reťazci, pričom táto aktivita je taktiež závislá od polarity. 5',3'-exonukleázovú aktivitu využívajú niektoré prokaryotické polymerázy na odstránenie RNA primerov počas replikácie DNA (u eukaryotov túto funkciu plní špecifický enzým RNáza H). 3',5'-exonukleázová aktivita sa nazýva cudzím pomenovaním proof-reading (čítaj „prúf-ríding“, t. j. kontrolné čítanie). Ak DNA-polymeráza nesprávne zaradí nukleotid, ktorý nezodpovedá správnemu párovaniu báz, táto aktivita jej umožňuje odštiepiť nesprávnu bázu, vrátiť sa o krok späť a dosyntetizovať správny nukleotid. Proof-reading aktivita teda výrazne znižuje frekvenciu spontánnych mutácií zapríčinených chybovosťou polymerázy.
Ďalší pojem, ktorý s DNA-polymerázami úzko súvisí, je procesivita. DNA-polymeráza s vysokou procesivitou dokáže syntetizovať dlhé dcérske vlákno bez toho, aby sa počas syntézy vyviazala z matrice. Zabezpečuje ju tzv. posuvná svorka (angl. sliding clamp, u prokaryotov ide o β-svorku, u eukaryotov o proteín PCNA), ktorú na vlákno DNA nakladá proteín zvaný nakladač svorky (angl. clamp loader, u prokaryotov γ-komplex, u eukaryotov faktor RFC).
Prokaryotické DNA-polymerázy a ich funkcia:
- DNA-polymeráza I – odstraňovanie RNA-primerov a syntéza DNA do vzniknutej medzery, reparácia DNA, 5',3'- a 3',5'-exonukleázová aktivita
- DNA-polymeráza II – reparácia DNA, 5',3'- a 3',5'-exonukleázová aktivita
- DNA-polymeráza III – hlavný enzým replikácie DNA, disponuje 3',5'-exonukleázovou (proof-reading) aktivitou
- DNA-polymeráza IV – zúčastňuje sa tzv. SOS reparácie DNA, vysoká chybovosť – patrí medzi tzv. error-prone DNA polymerázy (zaraďujú aj chybné nukleotidy a dokážu „prečítať“ poškodený templát)
- DNA-polymeráza V – SOS reparácia DNA, error-prone polymeráza
Eukaryotické DNA-polymerázy a ich funkcia:
- DNA-polymeráza α – v komplexe s primázou syntetizuje RNA-primery a počiatočné úseky DNA pre Okazakiho fragmenty
- DNA-polymeráza β – reparácia DNA
- DNA-polymeráza γ – replikácia mitochondriálnej a chloroplastovej (plastidovej) DNA
- DNA-polymeráza δ – replikácia zaostávajúceho reťazca (Okazakiho fragmentov), 3',5'-exonukleázová aktivita
- DNA-polymeráza ε – replikácia vedúceho reťazca
Replikácia DNA u prokaryot link
Celý bakteriálny chromozóm predstavuje jediný replikón, keďže jeho replikácia začína na jednom špecifickom mieste – ori (angl. origin of replication = počiatok replikácie). Odvíjanie dvojzávitnice tu postupuje obojsmerne, čím vznikajú dve replikačné vidlice, ktoré sa po obídení celej kruhovej molekuly stretnú a replikáciu ukončia.
Na procese sa priamo podieľa kaskáda enzýmov:
- helikáza – odvíja komplementárne reťazce DNA (obnažené vlákna chránia SSB proteíny)
- DNA-primáza – syntetizuje krátky RNA-primer (5–10 nukleotidov), čím pripraví pôdu pre polymerázu
- DNA-polymeráza III – hlavný enzým, ktorý predlžuje reťazce zaraďovaním nových nukleotidov
- DNA-polymeráza I – vďaka svojej 5'–3' exonukleázovej aktivite odstraňuje RNA-primery a nahrádza ich komplementárnymi úsekmi DNA. Obidve polymerázy disponujú opravnou funkciou (proof-reading)
- DNA-ligáza – pevne spája medzery medzi Okazakiho fragmentami a novými úsekmi do súvislého vlákna
Replikácia F plazmidu link
F-plazmid patrí medzi konjugatívne plazmidy, ktoré sa prenášajú z donorovej (darcoskej) do recipientnej (prijímajúcej) bunky procesom konjugácie. Nesie gény nevyhnutné pre vytvorenie konjugačného pilusu a úspešný transfer.
Replikácia F-plazmidu pri konjugácii prebieha špecifickým mechanizmom tzv. valivej kružnice:
- špecifický enzým (Rep-proteín) vytvorí na dvojvláknovej kruhovej molekule jednoreťazcový zlom
- uvoľnený 5'-koniec sa začne cez pilus vťahovať do recipientnej bunky
- v donorovej bunke prebieha na uvoľnenom 3'-konci kontinuálna syntéza vedúceho reťazca (na 3'–5' matrici) Polymeráza sa po kružnici nepohybuje, namiesto toho sa otáča samotný plazmid, čo fyzicky podporuje pretláčanie 5'-konca do recipienta
- keď je prenesené celé vlákno, Rep-proteín spraví druhý zlom a replikácia v donorovej bunke je ukončená
- v recipientnej bunke začne na prichádzajúcom 5'–3' vlákne okamžite prebiehať diskontinuálna syntéza (cez Okazakiho fragmenty) na vytvorenie komplementárneho reťazca plazmidu
Špecifiká replikácie eukaryotickej DNA link
Replikácia jadrovej DNA eukaryotov prebieha v S-fáze bunkového cyklu (pred mitózou alebo prvým meiotickým delením). Hoci je jej princíp zhodný s bakteriálnou replikáciou, vyžaduje viac enzýmov a dodatočnú energiu (ATP) na rozvinutie komplementárnych vlákien.
- Replikóny – iniciácia nezačína na jednom mieste, ale vo viacerých chromatínových doménach súčasne (každá tvorí samostatný replikón). Z priestorových dôvodov sa najskôr replikuje prístupnejší euchromatín a až neskôr kondenzovaný heterochromatín.
- Elongácia – oproti prokaryotom vyžaduje syntéza dvoch vlákien spoluprácu viacerých polymeráz. Komplex DNA-polymerázy α s primázou najprv nasyntetizuje RNA primery a krátke počiatočné úseky DNA. Následne ju na zaostávajúcom reťazci nahradí DNA-polymeráza δ (ktorá po odstránení primerov enzýmom RNáza H dosyntetizuje Okazakiho fragmenty) a na vedúcom reťazci preberá kontinuálnu syntézu DNA-polymeráza ε.
Formovanie nukleozómov link
Keďže eukaryotická DNA je v jadre navinutá na histónoch (nukleozómoch), replikačná vidlica tento komplex tesne pred svojím prechodom dočasne rozkladá. Keďže replikáciou vznikajú dve molekuly DNA, bunka musí syntetizovať dvojnásobné množstvo histónov. Nové nukleozómy sa formujú okamžite za replikačnou vidlicou, pričom sa do nich náhodne začleňujú pôvodné aj novonasyntetizované histónové proteíny.
Problém replikácie lineárnych molekúl (Teloméry) link
Keďže eukaryotické chromozómy sú lineárne, pri odstraňovaní koncových RNA primerov na zaostávajúcom reťazci vzniká na 5'-konci medzera, ktorú štandardné polymerázy nedokážu zaplniť (nemajú voľný 3'-OH koniec na pripojenie nukleotidu). Materské vlákno tak na 3'-konci prečnieva. Bez špeciálneho mechanizmu by sa lineárne molekuly DNA s každou replikáciou postupne skracovali.
Tento problém rieši špecifický enzým – telomeráza, ktorá predlžuje prečnievajúce konce chromozómov (teloméry).
- Telomeráza funguje ako reverzná transkriptáza – obsahuje vlastný krátky reťazec RNA (s motívom AAUCCC), ktorý slúži ako matrica (templát).
- Na základe komplementarity k tejto RNA predlžuje telomeráza prečnievajúci 3'-koniec materského chromozómu pridávaním DNA nukleotidov (u človeka ide o opakujúcu sa sekvenciu TTAGGG).
- Enzým sa po nasyntetizovaní úseku posunie a proces niekoľkokrát zopakuje.
- Na takto umelo predĺžený materský reťazec sa následne naviaže primáza, vytvorí nový RNA primer a DNA-polymeráza chýbajúci koncový úsek chromozómu bezpečne dosyntetizuje.
