Replikácia DNA

Objav štruktúry DNA v roku 1953 Watsonom a Crickom ponúkol jednoduché riešenie, ako môže dochádzať k replikácii DNA. Princípom tohto tzv. semikonzervatívneho modelu replikácie je, že dochádza k rozpletaniu dvojzávitnice DNA, t.j. zanikaniu vodíkových väzieb medzi protiľahlými bázami, pričom obidve jednovláknové reťazce DNA tvoria vzor - matricu (templát) pre syntézu nového protiľahlého reťazca na základe komplementarity bá. Názov modelu je odvodený od faktu, že nová kópia DNA pozostáva z jedného pôvodného (rodičovského) a jedného novosyntetizovaného (dcérskeho) vlákna (semi- alebo polokonzervatívny). Celý proces prebieha za spoluúčasti mnohých enzýmov, z ktorých najdôležitejší je DNA-polymeráza.

Všeobecný priebeh replikácie

Priebeh replikácie možno rozdeliť do 3 fáz, ktoré sú v princípe u prokaryot a eukaryot rovnaké:

  1. iniciácia
  2. elongácia
  3. terminácia

Iniciácia replikácie

Replikácia začína tvorbou tzv. replikačnej vidlice, čo je miesto, kde dochádza k rozpletaniu dvojzávitnice DNA za pomoci enzýmu helikázy. Tým je určený začiatok replikácie a uvoľnený priestor pre enzýmy, ktoré sa zúčastňujú ďalších procesov.

Elongácia replikácie

Do miesta replikačnej vidlice smeruje enzým primáza, ktorý na základe komplementarity nasyntetizuje krátky úsek RNA nazývaný primer (čítaj 'prajmer'). Ten je nevyhnutný pre DNA-polymerázu, ktorá dokáže syntetizovať celý komplementárny dcérsky reťazec predlžovaním tohto primeru v smere 5'-3' postupným zaraďovaním voľných nukleotidov a ich spájaním (polymerizáciou) do súvislého vlákna.

Na matrici, ktorá má smer 3'-5', sa syntetizuje vedúci reťazec (angl. leading strand) nepretržite (kontinuálne) v smere 5'-3', pričom na jeho syntézu postačí jeden RNA primer. Avšak na matrici, ktorá má smer 5'-3', nemôže dochádzať ku kontinuálnej syntéze, pretože žiadna známa DNA-polymeráza nepredlžuje reťazec v smere 3'-5'. Rieši sa to tak, že po nasyntetizovaní RNA primeru predĺži DNA-polymeráza tento primer o úsek DNA dlhý 1000-2000 nukleotidov nazývaný Okazakiho fragment v smere 5'-3', čo je umožnené dočasnou zmenou tvaru (konformácie) matricového reťazca. Takto syntetizovaný dcérsky reťazec sa nazýva zaostávajúci reťazec (angl. lagging strand). K ďalšiemu predlžovaniu zaostávajúceho reťazca je potrebný ďalší RNA primer, ktorý sa predĺži o ďalší Okazakiho fragment, atď. Syntéza zaostávajúceho reťazca je teda diskontinuálna. Proces, kedy sa jeden reťazec DNA replikuje kontinuálne (postupne a súvisle až do konca) a druhý diskontinuálne (prerušovane), nazývame semidiskontinuálna syntéza.

Krátko po syntéze Okazakiho fragmentov dochádza k odstráneniu RNA primerov a dosyntetizovaniu DNA nukleotidov v smere 5'-3' iným druhom DNA-polymerázy. Medzery medzi Okazakiho fragmentami a novosyntetizovanými úsekmi DNA spojí dokopy enzým DNA-ligáza vytvorením fosfodiesterovej väzby.

Terminácia replikácie

Replikácia DNA končí vtedy, keď je zreplikovaná celá molekula. To vedie k vyviazaniu DNA-polymerázy a ukončeniu polymerizácie.

Všetky popísané procesy prebiehajú v bunke úplne prirodzene pomocou postupného cieleného zapájania rôznych enzýmov. Niektoré z týchto enzýmov využívame aj pri tvorbe rekombinantných DNA molekúl, napr. pri PCR reakcii používame špeciálne upravenú DNA-polymerázu a primery, pomocou ktorých replikujeme cielené úseky DNA; pri klonovaní DNA zas využívame na spájanie vektora s inzertom špeciálne upravenú DNA-ligázu.

Úloha DNA-polymeráz

Existuje viacero druhov DNA-polymeráz, všetky však pripájajú deoxyribonukleozid-5'-monofosfáty (skrátene dNMP) k 3'-OH koncu syntetizovaného reťazca podľa komplementarity báz na matricovom reťazci, pričom ako substrát vyžadujú RNA alebo DNA primer, voľné deoxyribonukleozid-5'-trifosfáty (dNTP) a ióny Mg2+:

Všetky predlžujú dcérsky reťazec v smere 5'-3', tzn. že majú 5',3'-polymerázovú aktivitu. Niektoré sa vyznačujú aj exonukleázovou aktivitou, tzn. že odstraňujú nukleotidy prítomné na dcérskom reťazci, pričom je taktiež táto aktivita závislá na polarite reťazca DNA. 5',3'-exonukleázovú aktivitu využívajú niektoré polymerázy na odstránenie RNA primerov počas replikácie DNA. 3',5'-exonukleázová aktivita sa nazýva cudzím pomenovaním proof-reading (čítaj 'prúf-ríding') aktivita. Nie je vlastnosťou všetkých polymeráz. Ak DNA-polymeráza nesprávne zaradí nukleotid, ktorý nezodpovedá správnemu párovaniu báz, táto aktivita umožňuje polymeráze odštiepiť túto nesprávne zaradenú bázu, vrátiť sa jeden krok späť a následne dosyntetizovať správny nukleotid. Proof-reading aktivita teda znižuje frekvenciu spontánnych mutácií zapríčinených chybovosťou DNA-polymerázy.

Ďalší pojem, ktorý súvisí s DNA-polymerázami, je procesivita. DNA-polymeráza s vysokou procesivitou dokáže syntetizovať dcérske vlákno bez toho, aby sa vyviazala z matrice počas syntézy. Procesivita teda súvisí so schopnosťou "udržať" sa na matrici a syntetizovať dlhé kusy DNA pomocou jednej molekuly enzýmu.

Prokaryotické DNA-polymerázy a ich funkcia:

  • DNA-polymeráza I - odstraňovanie RNA-primerov a syntéza DNA pri replikácii, reparácia DNA, 5',3' a 3',5'-exonukleázová aktivita
  • DNA-polymeráza II - reparácia DNA, 5',3' a 3',5'-exonukleázová aktivita
  • DNA-polymeráza III - hlavný enzým replikácie DNA, 3',5'-exonukleázová aktivita
  • DNA-polymeráza IV - zúčastňuje sa tzv. SOS reparácie DNA, vysoká chybovosť - patrí medzi tzv. error-prone DNA polymerázy (zaraďujú aj chybné nukleotidy, okrem toho dokážu "prečítať" aj poškodený templát)
  • DNA-polymeráza V - SOS reparácia DNA, error-prone polymeráza

Eukaryotické DNA-polymerázy a ich funkcia:

  • DNA-polymeráza α - v komplexe s primázou syntéza RNA-primerov a časti Okazakiho fragmentov, 5',3' a 3',5'-exonukleázová aktivita
  • DNA-polymeráza β - reparácia DNA
  • DNA-polymeráza γ - replikácia mitochondriálnej DNA
  • DNA-polymeráza δ - replikácia zaostávajúceho reťazca, 3',5'-exonukleázová aktivita
  • DNA-polymeráza ε - replikácia vedúceho reťazca

Replikácia DNA u prokaryot

Replikácia kruhového bakteriálneho chromozómu začína na jednom jedinom mieste, ktoré sa označuje ori (angl. origin of replication = pôvod, počiatok replikácie). Celý bakteriálny chromozóm teda predstavuje jeden veľký replikón, čím sa pomenúva molekula DNA alebo jej časť s vlastným počiatkom replikácie. V tomto mieste začína odvíjanie dvojzávitnice DNA, ktoré pokračuje oboma smermi, výsledkom čoho sú teda dve replikačné vidlice. Na začiatku replikačnej vidlice je helikáza, ktorá odvíja komplementárne reťazce DNA. Za helikázou nasleduje DNA-primáza, ktorá syntetizuje krátky RNA-primer (5-10 nukleotidov RNA). Tieto primery sú potom predĺžené DNA-polymerázou III spôsobom, aký je uvedený v charakteristike elongácie replikácie vyššie. RNA-primery sú potom následne odstránené DNA-polymerázou I s 5',3'-exonukleázovou aktivitou, ktorá namiesto nich dosyntetizuje komplementárne úseky DNA. Obidve polymerázy majú taktiež proof-reading aktivitu (3',5'-exonukleázovú aktivitu). Medzery medzi týmito úsekmi a Okazakiho fragmentami spojí dohromady DNA-ligáza. Replikácia DNA končí, keď dôjde k spojeniu obidvoch replikačných vidlíc.

Replikácia F plazmidu

F plazmid patrí medzi konjugatívne plazmidy, ktoré sa prenášajú z donorovej bunky do recipientnej procesom konjugácie. Plazmidová DNA nesie, okrem iného, základnú informáciu pre syntézu štruktúr a makromolekúl potrebných pre úspešný tranfer F plazmidu. Konjugácia je jedným z troch procesov (tiež transformácia a transdukcia), akým možno mapovať prokaryotické gény, tzn. určovať ich poradie a vzdialenosti na DNA.

Replikácia F plazmidu prebieha spôsobom tzv. valivej kružnice. Najprv vznikne (pomocou Rep-proteínu) na dvojvláknovej kruhovej molekule jednoreťazcový zlom, pričom tento voľný koniec je 5'-koncom vťahovaný do recipientnej bunky cez konjugatívny pilus. Medzitým prebieha v donorovej bunke kontinuálna syntéza vedúceho reťazca na 3'-5' matrici. Vťahovanie pôvodného 5'-3' vlákna cez pilus do recipientnej bunky a syntéza DNA na 3'-5' vlákne pomocou DNA-polymerázy prebiehajú na jednom mieste, pričom nepohybuje sa DNA-polymeráza po kružnici, ale naopak otáča sa kružnica (plazmid). Toto otáčanie kruhovej molekuly plazmidu navyše podporuje pretláčanie pôvodného 5'-3' vlákna do recipienta. Keď je prenesené celé vlákno plazmidu, Rep-proteín spraví druhý zlom tohto reťazca a následne na to je replikácia F plazmidu v donorovej bunke ukončená. V recipientnej bunke prebieha súčasne diskontinuálna syntéza cez Okazakiho fragmenty, akonáhle sa 5'-3' vlákno z donorovej bunky začne objavovať v recipientnej.

Replikácia DNA u eukaryot

Replikácia eukaryotickej jadrovej DNA prebieha v S-fáze bunkového cyklu pred mitotickým alebo I. meiotickým delením. Zúčastňuje sa jej viac enzýmov ako u prokaryot ale v princípe je zhodná s bakteriálnou replikáciou.

Iniciácia eukaryotickej replikácie začína v chromatínových doménach, čo sú jednotlivé "slučky" DNA pripojené na proteínové chromozómové lešenie. Každá chromatínová doména teda predstavuje samostatný replikón. Podobne ako u prokaryot aj tu prebieha replikácia obomi smermi replikačnej vidlice. Rozdiel je v tom, že v prípade eukaryot je potrebná dodatočná energia v podobe ATP na rozvinutie komplementárnych vláken, zatiaľčo u prokaryot k tomu postačuje väzba niekoľkých proteínov, ktoré sú bez pomoci ATP schopné dvojzávitnicu rozpliecť. Najskôr začína replikácia euchromatínu, až neskôr sa zreplikuje heterochromatín, pravdepodobne z priestorových dôvodov, pretože heterochromatín je viac kondenzovaný a tým aj menej prístupný replikačným enzýmom.

Na rozdiel od prokaryotickej elongácie, u eukaryot sú pre kompletnú syntézu vedúceho a zaostávajúceho reťazca potrebné dva typy DNA-polymeráz. DNA-polymeráza α tvorí stály komplex s eukaryotickou primázou. Tento komplex najprv nasyntetizuje RNA primery (primáza) a časť Okazakiho fragmentov na zaostávajúcom reťazci (DNA-polymeráza α). Potom je enzým vyviazaný a nahradený DNA-polymerázou δ, ktorá spolu s RNázou H odstránia svojou exonukleázovou aktivitou RNA primery a dosyntetizujú namiesto nich zaostávajúci reťazec s využitím voľných dNTP. DNA-polymeráza δ zároveň syntetizuje kontinuálne vedúci reťazec.

Replikácia DNA končí podobne ako v prípade prokaryot pri strete dvoch replikačných vidlíc.

Formovanie nukleozómov

Eukaryotická DNA je v jadre v komplexe s histónmi, s ktorými vytvára nukleozómy. Tento nukleoproteínový komplex sa významne podieľa na organizácii chromatínu a štruktúre chromozómov, takže počas replikácie naň netreba zabúdať. Nukleozómy sa rozpadajú tesne pred pohybom replikačných vidlíc, pričom voľné históny sú okamžite využité na formovanie nových nukleozómov. S replikáciou DNA však nastáva aj syntéza nových histónov, pretože je ich potrebné dvojnásobné množstvo. Počas replikácie teda dochádza k vzniku nových nukleozómov, na výstavbe ktorých sa podieľajú ako pôvodné tak aj novosyntetizované histónové proteíny.

Problém replikácie lineárnych molekúl DNA

Keďže eukaryotické chromozómy sú takmer výlučne lineárne, nastáva tu určitý problém s replikáciou ich koncov. Tento problém syntézy lineárnych dvojvláknových molekúl DNA je v tom, že po replikácii vznikajú po odstránení RNA primerov jednovláknové konce, ktoré prečnievajú komplementárne vlákno o niekoľko nukleotidov na 3'-konci, čo predstavuje dĺžku pôvodného RNA primeru. Obrázok znázorňuje, ako niekoľko za sebou nasledujúcich replikácii skracuje lineárnu molekulu DNA.

Riešením tohto fenoménu je existencia špeciálnych polymeráz, ktoré predlžujú tieto 3'-konce, takže aj keď dôjde počas replikácie k odstráneniu RNA primerov, výsledná dĺžka chromozómu sa nezmení. Nazývajú sa telomerázy. U človeka pridávajú na koniec chromozómov telomerickú sekvenciu TTAGGG.

Telomeráza je enzým, ktorý vo svojej molekule obsahuje krátky reťazec RNA komplementárny k 3'-koncu chromozómových telomér. Na základe tohto RNA "templátu" telomeráza pridáva DNA nukleotidy (z voľných dNTP) k 3'-prečnievajúcemu koncu chromozómu. Vo svojej podstate je to teda reverzná transkriptáza, ktorá podľa RNA templátu syntetizuje reťazec DNA.

Telomeráza sa na 3'-prečnievajúci koniec naviaže na základe komplementarity báz jej RNA zložky, pričom dosyntetizuje sekvenciu DNA nukleotidov, ako je vidieť na obrázku. Potom sa enzým o niekoľko nukleotidov posunie a dosyntetizuje telomérickú sekvenciu. Takýmto spôsobom syntetizuje niekoľko telomérických opakovaní TTAGGG. Napokon je zahájená nová syntéza RNA primeru a DNA polymeráza následne dosyntetizuje nový úsek DNA. Po odstránení primeru vznikne opäť medzera, ale chromozóm je už predĺžený.