Elektroforéza nukleových kyselín

Separácia (frakcionácia) nukleových kyselín predstavuje oddelenie rôznych molekúl DNA alebo RNA v spoločnej zmesi (roztoku) na základe veľkosti, zloženia a poradia báz. Rovnako účinne možno podobnými technikami separovať aj proteíny, ku ktorým sa pripája ešte možná separácia podľa celkového náboja (nepolárne, polárne, záporne a kladne nabité aminokyseliny). Nukleové kyseliny sú všetky kyslé (z toho aj názov - kyseliny) v dôsledku prítomnosti fosfátovej skupiny (fosfátovej kostry), takže separácia na základe náboja nezohráva úlohu.

Elektroforéza (skratka ELFO) využíva schopnosť nukleových kyselín putovať (migrovať) ku kladne nabitému pólu (k anóde; záporne nabitá je katóda). Elektroforéza prebieha v elektroforetickej aparatúre v gélovitých roztokoch, ktoré vytvárajú sieťovitú štruktúru, čím separujú molekuly odlišujúce sa tvarom a veľkosťou. Elektroforetická aparatúra generuje prostredníctvom zdroja určité napätie, ktoré možno nastaviť.

Vzorka DNA (alebo RNA) sa nanáša do jamiek (vytvorených v géli pomocou špeciálneho zubatého plastu - hrebeň) v roztoku s farbiacou látkou, aby bolo možné sledovať jej približnú polohu v géli v čase. Vodorovná "čiara", v ktorej sa pohybujú molekuly nukleovej kyseliny od katódy k anóde pochádzajúce z jednej vzorky, sa nazýva dráha (angl. lane). V dráhe sú jednotlivé fragmenty DNA (alebo RNA) určitých veľkostí viditeľné ako prúžky (angl. bands). Intenzita prúžkov po ich vizualizácii závisí priamo úmerne od množstva prítomnej DNA (alebo RNA).

Jedna farbiaca látka (napr. brómfenolová modrá) sa používa ako prísada do roztoku so sledovanou vzorkou jednak aby sme vzorku pri pipetovaní do jamky videli a presne naniesli a jednak je táto farbička spravidla nízkomolekulová, takže vizualizuje časový priebeh elektroforetickej separácie, lebo ju celý čas vidno. Druhá farbiaca látka je spravidla neviditeľná (napr. etídiumbromid) a reaguje s nukleovou kyselinou. Zobrazí sa až po vizualizácii (typicky pod UV svetlom) a ukazuje nám pozície konkrétnych fragmentov DNA (alebo RNA).

V niektorej dráhe je spravidla štandard molekulových hmotností (angl. DNA ladder), v ktorej sa separujú presne veľkostne definované fragmenty DNA (alebo RNA) (100 bp, 200 bp, 500 bp...) umožňujúce odhadnúť veľkosti ako aj hmotnosť neznámych fragmentov vo zvyšných dráhach.

Rýchlosť pohybu nukleových kyselín v géli

Rýchlosť pohybu (mobilita) nukleových kyselín v géli závisí od niekoľkých faktorov:

  • veľkosť nukleovej kyseliny, t.j. počet báz, resp. bázových párov
  • konformácia (tvar) nukleovej kyseliny
  • hustota gélu, t.j. koncentrácia gélotvornej látky
  • zloženie gélu
  • napätie zdroja elektroforetickej aparatúry

Veľkosť molekuly

Menšie molekuly prechádzajú gélom rýchlejšie, pretože sa ľahšie pohybujú v sieťovitej štruktúre gélu. Veľkosť jednotlivých fragmentov DNA možno odčítať zo štandardu molekulových hmotností.

Tvar molekuly

Predovšetkým rôzne formy plazmidovej DNA putujú v géli napriek rovnakej veľkosti (počtu bázových párov) odlišne: kondenzované superšpiralizované plazmidy tvoria kompaktnejšiu štruktúru, a preto putujú rýchlejšie ako rovnako veľké lineárne molekuly a tie zas putujú rýchlejšie ako relaxované kruhové molekuly.

Hustota gélu

Hustota gélu určuje jeho rozlišovaciu schopnosť pre rôzne veľké fragmenty. Hustejší gél vytvára aj hustejšiu sieťovitú štruktúru, ktorá jemnejšie rozdeľuje najmä kratšie fragmenty. Redšie gély sa naopak hodia pre lepšie rozlíšenie veľkých fragmentov.

Zloženie gélu

Pri zachovaní sekundárnych štruktúr jednovláknových foriem nukleových kyselín (ssDNA, RNA) dochádza k vnútromolekulovému párovaniu medzi bázami a takéto molekuly ťažšie prechádzajú gélom. Tento fakt využívajú niektoré elektroforetické techniky úpravou zloženia gélu, pretože ním možno odhaliť aj zámenu jedinej bázy. Inak je metóda separácie makromolekúl na základe konformácie využívaná najmä pre separáciu proteínov v ich nedenaturovanom (natívnom, biologicky aktívnom) stave.

Napätie zdroja

Čím vyššie je napätie zdroja, ktoré generuje v elektroforetickej aparatúre elektrické pole, tým rýchlejšie prebieha separácia. Vyššie napätie zároveň zvyšuje tvorbu tepla, ktoré zohrieva aparatúru a môže negatívne ovplyvniť celkový výsledok separácie. Pri vyššej teplote môže dochádzať k difundovaniu kratších fragmentov do gélu, čo zhoršuje ich detekciu alebo identifikáciu. V lepšom prípade môže byť príčinou "rozmazaných" prúžkov v smere pohybu fragmentov, takže výsledok (ak by aj potvrdzoval hypotézu) nie je vhodný do publikácie.

Štandard molekulových hmotností

Je to zmes fragmentov DNA s presne definovanými veľkosťami (1000 bp, 1500 bp, 2000 bp...), ktoré počas elektroforetickej separácie vytvoria známy obraz, tzv. "rebrík", preto sa im v anglickej terminológii hovorí ladder. Štandard, alebo marker molekulových hmotností, nám slúži na odhad veľkostí a identifikáciu fragmentov DNA v neznámych vzorkách, resp. potvrdenie očakávaných veľkostí fragmentov, preto by mal byť súčasťou každej separácie s týmto účelom.

Pomocou markerov DNA možno dokonca čiastočne kvantifikovať (určiť množstvo) nukleovej kyseliny v neznámych prúžkoch, pretože okrem veľkostí fragmentov markera je známa aj ich hmotnosť. Niektoré silnejšie vidideľné prúžky sú tzv. referenčné veľkosti a zvyčajne sú nimi okrúhle hodnoty (napr. 1000 bp). Existuje množstvo druhov markerov DNA s rôznym rozsahou hodnôt veľkostí fragmentov (napr. 100-3000 bp, 250-10000 bp).

Ukážka markera DNA s rozmedzím hodnôt 100-3000 bp v agarózovom (vľavo) a polyakrylamidovom géli (vpravo). Referenčné prúžky sú 500 bp a 1000 bp. Prostredný stĺpec číselných hodnôt udáva množstvo DNA prítomného v jednotlivých prúžkoch za podmienok, že celková hmotnosť markera naneseného na gél je 0,5 µg. Podmienky elektroforetickej separácie (dĺžka gélu, použitý pufor, napätie aparatúry, čas separácie) sú uvedené pod obrázkami.

Elektroforetické tlmivé roztoky

Aby sa zachovali stabilné podmienky počas separácie, gél je v elektroforetickej aparatúre ponorený do tlmivého roztoku (pufrovací roztok, pufor) (angl. buffer). Elektroforetické tlmivé roztoky dodávajú ióny, ktoré vedú elektrický prúd pri elektroforéze. Medzi najpoužívanejšie patria:

Tab. Elektroforetické tlmivé roztoky
puforoznačeniezloženie
Tris-AcetátTAETris báza, ľadová kyselina octová, EDTA
Tris-BorátTBETris báza, kyselina boritá, EDTA
Tris-FosfátTPETris báza, H3PO4, EDTA

Tris báza [2-amino-2-hydroxymetylpropán-1,3-diol; C4H11NO3]
EDTA - kyselina etyléndiamíntetraoctová [C10H16N2O8]

Nanášacie tlmivé roztoky (angl. loading buffer) sú koncentrované roztoky, ktoré sa miešajú so vzorkou DNA (alebo RNA) pred nanášaním na gél. Obsahujú zložku na zvýšenie hustoty (sacharóza, glycerol, ficoll), aby pri nanášaní na gél klesla vzorka na dno a nerozptýlila sa v elektroforetickom pufri. Taktiež obsahujú farbivá (brómfenolová modrá, xylencyanol), ktoré sa pri elektroforéze pohybujú rovnakým smerom ako DNA a umožňujú sledovať jej približnú pozíciu v géli v čase. Príklad zloženia typického nanášacieho roztoku:

40% sacharóza
0,25% brómfenolová modrá
0,25% xylencyanol

Vizualizácia DNA

Samotná DNA je počas separácie v géli neviditeľná. Vizualizuje (zviditelňuje) sa najčastejšie použitím fluorescenčného činidla - etídiumbromidu (skratka EtBr), kde ju v jednotlivých dráhach vidno ako spomínané prúžky. Čím väčšie množstvo DNA je v prúžku, tým viac EtBr sa viaže, a tým je intenzita fluorescencie vyššia. Etídiumbromid sa včleňuje (interkaluje) medzi susediace bázy DNA a po ožiarení UV svetlom oranžovo fluoreskuje. EtBr možno pridať priamo do gélu pri jeho príprave a priebežne kontrolovať pozíciu fragmentov DNA na géli, alebo sa gél farbí až po elektroforetickej separácii.

EtBr patrí medzi najúčinnejšie chemické mutagény, takže je nutné prísne dodržiavať bezpečnostné predpisy!

Elektroforetické gély

V závislosti od povahy elektroforetických gélov rozlišujeme dva hlavné typy:

  • agarózový gél
  • polyakrylamidový gél

Elektroforéza v agarózovom géli

Agaróza je lineárny polymér D-galaktózy a galaktózového derivátu (3,6-anhydro-L-galaktózy), ktorý sa získava purifikáciou agaru (výťažok z červených rias). Agarózový gél možňuje rozlíšiť fragmenty DNA veľkosti od 50 bp po niekoľko megabáz (milión báz), tradične sa však používa pre rozlíšenie fragmentov od 100 do 20000 bp. Možno použiť gély s koncentráciou 0,1-3% agarózy (najčastejšie 1 až 2%), pričom hustejšia agaróza rozdeľuje efektívnejšie menšie fragmenty ale DNA v nej putuje celkovo pomalšie, takže je potrebný dlhší čas separácie (pri rovnakom napätí aparatúry). Agarózový gél možno použiť aj pre separáciu RNA.

Tab. Oblasti efektívneho rozdelenia molekúl DNA v agarózovom géli
koncentrácia agarózy
(%)
oblasť efektívneho
rozdelenia DNA
(kbp)
0,360 - 5
0,620 - 1
0,710 - 0,8
0,97 - 0,5
1,26 - 0,4
2,03 - 0,1

Agaróza je jemný prášok, ktorý je pri laboratórnej teplote nerozpustný vo vode. Za účelom prípravy agarózového gélu sa rozvára v elektroforetickom pufri (najčastejšie TAE) a nalieva do formy ("vaničky"), kde po poklese teploty stuhne na gél. Vo forme je založený hrebeň, ktorý svojimi zárezmi vymodeluje po stuhnutí gélu jamky. DNA sa pipetuje do jamiek rozriedená v nanášacom pufri. Gél aj s formou sa potom vložia do elektroforetickej aparatúry tak, aby jamky boli umiestnené bližšie ku katóde (-). Agarózový gél musí byť v aparatúre ponorený v rovnakom pufri, v akom bola agaróza rozváraná! Agarózová gélová elektroforéza "beží" v horizontálnej elektroforetickej aparatúre, tzn. vodorovne s povrchom stola.

Elektroforéza v polyakrylamidovom géli

Akrylamid (C3H5NO) je biela kryštalická látka ľahko rozpustná vo vode. Polyakrylamidový gél vzniká polymerizáciou akrylamidu, ktorá sa docieli špeciálnymi chemickými látkami, takže sa jeho príprava zásadne odlišuje od prípravy agarózového gélu. Polyakrylamidové gély majú rozlišovaciu schopnosť až 1 bázový pár, takže sú vhodné aj na sekvenovanie DNA klasickými metódami; na druhej strane sa však nehodia na separáciu veľkých fragmentov (rozdiel viac ako 200 báz). Používajú sa koncentrácie 4-15% gélu (najčastejšie 6-10%). Elektroforéza v polyakrylamidovom géli sa označuje hojne používanou skratkou PAGE (angl. polyacrylamide gel electrophoresis). PAGE s upraveným zložením gélu a odlišným zložením elektroforetického roztoku sa veľmi často používa aj na separáciu proteínov.

Tab. Oblasti efektívneho rozdelenia molekúl DNA v PAGE
koncentrácia akrylamidu
(%)
oblasť efektívneho
rozdelenia DNA
(bp)
4> 200
5200 - 80
8100 - 40
1250 - 10

Polymerizovaný akrylamid vytvára lineárne reťazce. Aby gél tvoril sieť, v ktorej bude migrovať DNA, používa sa malé množstvo bisakrylamidu, ktorý svojou štruktúrou umožňuje vetvenie reťazcov.

Polymerizácia akrylamidu neprebieha spontánne, ale sú k nej potrebné látky, ktoré iniciujú formovanie polymérov a spúšťajú reťazovú polymerizáciu. Peroxodisíran amónny (skrátene persíran amónny, skratka APS) iniciuje formovanie gélu tým, že atakuje molekuly ďalšej látky - TEMEDu (skratka pre istý kvartérny amín) - ktorý tvorí ióny narušujúce reaktívne skupiny akrylamidu, ten potom reaguje s ďalšou molekulou akrylamidu, pričom už sám z nej vytvára ďalšiu reaktívnu látku až vzniká dlhý polymér.

Zmes na prípravu 10 ml polyakrylamidového gélu môže mať nasledovné zloženie:

4% PAGE
1 ml 40% akrylamid/bisakrylamid (19:1)
2 ml 5x TBE
10 µl TEMED
50 µl 10% APS
6,94 ml destilovaná H2O

6% PAGE
1,5 ml 40% akrylamid/bisakrylamid (19:1)
2 ml 5x TBE
10 µl TEMED
50 µl 10% APS
6,44 ml destilovaná H2O

Pripravené zložky sa zmiešajú, pričom nakoniec sa pridajú katalyzátory polymerizácie TEMED a APS. Pripravená zmes sa naleje medzi dve sklá a nechá sa polymerizovať. Takto vytvorené gély sa spolu so sklami použíjú na elektroforézu. PAGE "beží" vo vertikálnej elektroforetickej aparatúre (tzn. kolmo na povrch stola), pričom ako elektroforetický pufor sa používa najčastejšie TBE. Katóda (-) je orientovaná navrchu a anóda (+) na spodnej strane aparatúry, takže fragmenty DNA migrujú zhora nadol.