Polymerázová reťazová reakcia - PCR

Polymerázová reťazová reakcia (angl. polymerase chain reaction, skratka PCR) je základná metóda molekulárnej biológie, ktorá slúži na amplifikáciu (zmnoženie) molekúl DNA v laboratórnych podmienkach využívajúc enzým DNA-polymerázu a synteticky pripravené oligonukleotidy. Zmnožená molekula DNA sa nazýva PCR produkt alebo amplikón. PCR je exponenciálna reakcia a teoreticky je možné aj z jedinej molekuly DNA vytvoriť ľubovoľné množstvo kópií.

Táto metóda bola revolučným objavom Američana KARYHO MULLISA (1944–2019) v roku 1983 (Nobelova cena za chémiu v roku 1993) a dnes je súčasťou mnohých komplexnejších metodík a analýz. Štandardne sa používa v molekulárnej biológii, genetike, mikrobiológii, fyziológii, medicíne ako aj v mnohých iných oblastiach biologického výskumu. Aplikácie PCR sú v mnohých prípadoch rýchlejšou a lacnejšou náhradou klasických molekulárno-biologických metód akými sú klonovanie DNA a northernova hybridizácia.

Čo budeme potrebovať... link

Žiadna DNA-polymeráza nezačne syntézu komplementárneho vlákna DNA bez prekurzoru v podobne krátkeho vlákna DNA alebo RNA. Primer (čítaj „prajmer“) je krátky oligonukleotid, ktorým sa iniciuje replikácia DNA v podmienkach živej bunky, ale taktiež aj v laboratórnych podmienkach (in vitro). Primer na základe komplementarity nasadá na vlákno DNA a následne sa predlžuje polymerázou v smere 5'–3'.

Často nie je potrebné namnožiť celú molekulu DNA, ale len niektoré jej úseky (napr. gény), takže potreba použiť primer je naopak veľkou výhodou. Do PCR sa preto štandardne pridávajú dva odlišné oligonukleotidy v rovnakej koncentrácii, ktorými sa „označí“ ľavý (priamy primer, angl. forward) a pravý koniec (reverzný primer, angl. reverse) amplifikovanej DNA. Dochádza teda k namnoženiu len takých kusov DNA, ktoré sú ohraničené týmito primermi.

Podmienkou replikácie DNA je taktiež jej denaturácia, t. j. oddelenie dvoch vláken dvojvláknovej DNA. K tomu je potrebná vysoká teplota (cca 90–100 °C). Do PCR sa preto pridáva termostabilná rekombinantná Taq-polymeráza (DNA-polymeráza izolovaná z termofilnej baktérie Thermus aquaticus žijúcej v termálnych prameňoch), ktorej optimálna aktivita sa dosahuje pri teplote 72 °C. V súčasnosti existuje viacero druhov rekombinantných Taq-polymeráz a iných (napr. Pfu-polymeráza) dodávaných rôznymi biotechnologickými firmami.

K syntéze nových molekúl DNA sú samozrejme potrebné „stavebné čiastočky“ v podobe deoxyribonukleozidtrifosfátov, alebo skrátene dNTP. Pomer všetkých štyroch zložiek (dATP, dCTP, dTTP a dGTP) musí byť rovnaký, aby nedochádzalo k chybám pri replikácii. Okrem toho každá DNA-polymeráza vyžaduje ako kofaktor pri polymerizácii horečnaté katióny (Mg²⁺) a v podmienkach in vitro aj vlastný tlmivý roztok (pufor), pri použití ktorého má optimálnu aktivitu a stabilitu.

DNA-polymeráza, primery, horčík, pufor a dNTP sa riedia v sterilnej destilovanej vode, výsledkom čoho je tzv. mastermix. PCR je veľmi citlivá na kontamináciu, a preto sa pri príprave roztoku mastermixu vyžaduje veľmi precízna a sterilná práca, takže sa pracuje za tzv. „DNA-free“ podmienok. Napokon sa do mastermixu pridáva vzorka DNA, ktorú chceme (resp. jej časť) amplifikovať. Nazýva sa aj templátová DNA (templát). Takto pripravená PCR reakčná zmes v mikroskúmavke sa vkladá do samotného prístroja na PCR reakciu, ktorý sa nazýva termálny cyklér alebo len cyklér.

Priebeh PCR link

Amplifikácia DNA metódou PCR sa uskutočňuje cyklickým procesom, pričom každý cyklus pozostáva z troch základných krokov:

1. denaturácia – tepelná denaturácia templátovej DNA zohriatím reakčnej zmesi na teplotu >90 °C
2. anelácia – za poklesu teploty na cca 45–65 °C (závisí od dĺžky a sekvencie primerov, najmä množstva G–C párov) nastáva hybridizácia primerov s templátovou DNA na komplementárnych miestach
3. polymerizácia – zvýšením teploty na 72 °C začína Taq-polymeráza syntetizovať komplementárne vlákno DNA z voľných dNTP

Tieto tri kroky sa cyklicky opakujú v termálnom cykléri 20 až 40-krát a výsledkom je vznik mnohých kópií fragmentu DNA ohraničeného použitými primermi. Množstvo PCR produktu v jednej reakcii môže dosiahnuť hodnoty 0,2–1 µg DNA, čo postačuje na analýzu štandardnými metódami molekulárnej biológie, akou je napr. elektroforéza v agarózovom géli.

Záverečná polymerizácia – tento voliteľný krok prebehne počas PCR len raz, a to úplne na konci programu. Slúži na „dobehnutie“ všetkých polymerizačných reakcií, ktoré ešte v zmesi prebiehajú.

Faktory ovplyvňujúce priebeh PCR link

Priebeh a úspešnosť PCR je možné charakterizovať pomocou nasledovných parametrov:

• špecificita – schopnosť amplifikovať len úseky s presnou komplementaritou sekvencií v oblasti primerov. Nižšie anelačné teploty a vyššia koncentrácia Mg²⁺ spravidla špecificitu znižujú, takže dochádza k amplifikácii tzv. nešpecifických fragmentov, ktoré pochádzajú mimo cieľovej oblasti.
• citlivosť – udáva množstvo templátu, ktoré je možné úspešne amplifikovať za použitých podmienok. Teoreticky možno amplifikovať aj jednu jedinú molekulu DNA, prakticky je potreba vstupného množstva o niečo vyššia.
• efektívnosť – aké percentuálne množstvo molekúl templátu sa prekopíruje v jednom cykle. Teoreticky sa kopírujú všetky molekuly, prakticky je toto množstvo vždy o niečo nižšie.
• fidelita – miera presnosti sekvencie PCR produktu v porovnaní s pôvodným templátom. Udáva, do akej miery je výsledný amplikón sekvenčne identický s originálom. Závisí hlavne od chybovosti enzýmu a pomeru jednotlivých dNTP.

Pri miere presnosti amplifikácie závisí od doby (v 1. alebo 20. cykle?), kedy polymeráza spraví chybu, tzn. zaradí odlišný nukleotid do sekvencie novosyntetizovanej DNA. Ak je účelom PCR namnoženie DNA pre následné sekvenovanie, používajú sa drahšie polymerázy s proof-reading aktivitou (napr. Pfu-polymeráza z Pyrococcus furiosus). Ide o 3',5'-exonukleázovú aktivitu, ktorá chybne zaradené nukleotidy ihneď odštiepi a nahradí správnymi. Taq-polymeráza túto vlastnosť štandardne nemá.

Pri miešaní mastermixu treba dbať na to, aby zmes neobsahovala inhibítory PCR, ktoré blokujú aktivitu polymerázy. K nim patria najmä detergenty, organické rozpúšťadlá, proteázy, nukleázy a nadbytok RNA, ktoré môžu v roztoku ostať po nedokonalej izolácii a purifikácii DNA vzorky z tkaniva.

Pozitívna a negatívna kontrola PCR link

Keď potrebujeme diagnostikovať prítomnosť neznámeho templátu (napr. vírusovej DNA), spravidla bežia v cykléri paralelne aj kontrolné skúmavky, ktoré nám potvrdzujú platnosť experimentu.

Pozitívna kontrola (pk) je extra PCR reakcia, kde ako templát použijeme známu referenčnú DNA, u ktorej máme absolútnu istotu, že reakcia prebehne. Slúži nám ako vzor toho, „ako to má na géli vyzerať“. Ak nedôjde k amplifikácii DNA v pozitívnej kontrole, znamená to, že bol zlý mastermix alebo program a nemôžeme sa spoľahnúť ani na výsledky u pacientov.

Negatívna kontrola (nk), v angličtine označovaná skratkou NTC (no template control), obsahuje všetky reagencie mastermixu s výnimkou templátovej DNA (namiesto nej sa pipetuje len voda). Prípadná amplifikácia DNA v tejto vzorke neomylne poukazuje na kontamináciu pracovného priestoru alebo reagencií cudzou DNA. Ak vyjde negatívna kontrola „pozitívne”, celý experiment sa stáva nedôveryhodným a musí sa opakovať v prísnejších „DNA-free“ podmienkach.

Návrh primerov link

Primery sú krátke oligonukleotidy, ktoré sa navrhujú ako primerový pár – priamy a reverzný primer. Teplota topenia (\(T_m\)) je hraničná teplota, pri ktorej je ½ primerov prítomná v jednovláknovej forme a druhá ½ je hybridizovaná k DNA. Anelačná teplota je cca o 4–5 °C nižšia ako \(T_m\), čím sa zvyšuje podiel primerov hybridizovaných s denaturovanou DNA počas anelačného kroku PCR.

Pri návrhu primerov treba dbať na určité pravidlá:

• ideálna teplota topenia je v rozmedzí 50–60 °C, pričom v rámci navrhovaného páru by nemal byť rozdiel väčší ako 5 °C
• ideálna dĺžka pre väčšinu aplikácií je 16–25 nukleotidov
• odporúčaná hodnota obsahu G–C párov je v rozmedzí 40–60 %
• rovnomerné rozmiestnenie nukleotidov (tzn. nemali by byť 4 rovnaké nukleotidy za sebou)
• sekvencia primerov musí byť jedinečná, aby nasadali len na špecifické miesto na templátovej DNA, pričom špecificita primeru je ovplyvnená predovšetkým sekvenciou na 3'-konci (na 5'-konci môže obsahovať nekomplementárne sekvencie)
• do mastermixu pridávať primery v rovnakej koncentrácii
• predchádzať vzniku komplementárnych úsekov v rámci jedného primeru (tvorba sekundárnych štruktúr, vláseniek, tzv. self-complementarity) a medzi primermi navzájom. Ak totiž pri párovaní priameho a reverzného primeru zostáva voľný 3'-koniec, dochádza k syntéze krátkych nešpecifických produktov, tzv. primer dimérov, ktoré extrémne znižujú účinnosť PCR

Teplotu topenia primerov možno približne vypočítať podľa klasického Wallaceovho pravidla:

\(T_m = 4 \times (\text{počet } C + \text{počet } G) + 2 \times (\text{počet } A + \text{počet } T)\)

Takáto teplota topenia sa označuje ako základná teplota topenia (angl. basic \(T_m\)) a považuje sa za najmenej presnú, avšak najčastejšie používanú na rýchly odhad v praxi. Pokročilú formu termodynamickej korekcie predstavujú modely salt-adjusted \(T_m\) a ešte presnejší nearest neighbour \(T_m\). V princípe je potrebné zvoliť takú anelačnú teplotu, ktorá je najvhodnejšia na optimalizáciu s ohľadom na ostatné parametre (koncentrácie komponentov, časy) a konkrétnu aplikáciu. PCR totiž negatívne ovplyvňujú najviac fenomény self-complementarity a tvorba primer dimérov.

Bioinformatické programy link

Bioinformatika je interdisciplinárna veda, spojenie biológie s informatikou. Neustálym rozvojom metód molekulárnej biológie, ako aj pribúdaním nových sekvencií DNA, RNA a proteínov, sa zvyšujú nároky na uchovávanie, triedenie a analýzu biologických dát pomocou počítača. Hlavnou úlohou bioinformatiky je vývoj softvéru pracujúceho s biologickými údajmi. Jedným z takých bioinformatických programov je aj softvér na návrh primerov.

Návrh (dizajn) primerov pre bežné diagnostické potreby už v súčasnosti nie je žiadny problém. Pre samotný návrh sa výborne osvedčila stránka amerického centra NCBI (National Center for Biotechnology Information), ktorá ponúka obrovskú databázu nukleových kyselín a bielkovín. Pomocou bioinformatického softvéru je možné dizajnovať niekoľko primerových párov súčasne. Ak by ste si chceli otestovať základné vlastnosti primerov (teplota topenia za rôzneho zloženia pufru, tvorba vnútorných vláseniek alebo primer dimérov), bezplatne a vynikajúco slúži softvér OligoAnalyzer od firmy IDT (Integrated DNA Technologies).

Variácie PCR link

Ide o modifikácie štandardného protokolu vyvinuté pre špecifické potreby diagnostiky a výskumu:

• hot-start PCR – bežná polymeráza má určitú aktivitu už pri izbovej teplote počas pipetovania zmesi. „Hot-start“ využíva enzým, ktorý je úplne neaktívny, kým sa zmes neohreje na aktivačnú teplotu (napr. 95 °C, 5 min), čo radikálne zvyšuje špecificitu.
• touchdown PCR – počiatočné cykly majú úmyselne veľmi vysokú anelačnú teplotu (tesne pod \(T_m\)), ktorá sa postupne znižuje. Zabezpečí sa tak väzba výlučne na špecifický cieľ.
• nested PCR – dvojkroková procedúra, pri ktorej sa v prvom kroku amplifikuje dlhší fragment, ktorý následne slúži ako templát pre druhú PCR s novou sadou „vnútorných“ primerov. Zvyšuje citlivosť aj špecificitu.
• multiplex PCR – v jednej reakčnej zmesi je prítomných viacero odlišných primerových párov, čo umožňuje amplifikáciu viacerých úsekov DNA naraz
• alelovo-špecifická PCR – primery sú navrhnuté tak, aby ich 3'-koniec prekrýval hľadanú mutáciu. Pri zdravej alele (kvôli nekomplementarite na 3'-konci) polymeráza nedokáže primer predĺžiť.
• mutagenéza prostredníctvom PCR – primery obsahujú cielene zmutované nukleotidy vo svojej strednej časti. Výsledkom je tvorba produktu s umelo vytvorenou sekvenciou.

Kvantitatívne a RNA variácie (qPCR a RT-PCR) link

V bežnej laboratórnej praxi (a najmä v diagnostike vírusových ochorení) je nevyhnutné presne rozlišovať nasledujúce pojmy, ktoré sa laicky často zamieňajú:

• real-time PCR (qPCR) – kvantitatívna metóda, pri ktorej prístroj priamo počas behu cykléra opticky meria nárast množstva DNA na základe narastajúcej intenzity fluorescencie v reálnom čase (slúži na presnú kvantifikáciu DNA).
• RT-PCR (reverzná transkripčná PCR) – slúži na analýzu izolovanej RNA (mRNA alebo RNA vírusov). Enzým reverzná transkriptáza ju najprv prepíše do komplementárnej DNA (cDNA), ktorá následne slúži ako templát pre klasickú PCR.
• RT-qPCR – spojenie oboch predchádzajúcich metód (reverznej transkripcie a následnej kvantifikácie v reálnom čase). Je to najvýkonnejšia metóda modernej diagnostiky RNA vírusov (napr. pri detekcii ochorenia COVID-19).

Aplikácie PCR link

Metódu PCR podľa jej hlavného cieľa logicky rozdeľujeme na dve základné odvetvia:

Analytická a diagnostická PCR link

Základnou aplikáciou je rýchla detekcia prítomnosti špecifického úseku DNA vo vzorke (hľadáme odpoveď na otázku, či sa tam daná DNA nachádza). Sem patrí najmä:

• klinická diagnostika – dôkaz prítomnosti ťažko kultivovateľných patogénnych mikroorganizmov a vírusov (napr. vírus HIV alebo baktéria Borrelia burgdorferi spôsobujúca boreliózu)
• lekárska genetika a onkológia – detekcia mutácií zodpovedných za dedičné ochorenia (napr. cystická fibróza) ešte pred ich prejavom a sledovanie špecifických markerov pri nádoroch
• kriminalistika a forenzné vedy – stanovenie jednoznačnej identity osôb pri vyšetrovaní alebo testoch otcovstva pomocou profilovania krátkych tandemových opakovaní (tzv. STR profilovanie, angl. DNA fingerprinting)
• poľnohospodárstvo a ekológia – sledovanie úžitkových vlastností plodín, šľachtenie zvierat a moderná analýza biodiverzity na základe odberu environmentálnej DNA (eDNA)

Preparatívna PCR link

Druhou hlavnou aplikáciou je cielene vyrobiť obrovské množstvo špecifickej čistej DNA, s ktorou sa bude následne pracovať v laboratóriu. PCR tu slúži ako produkčný nástroj:

• klonovanie génov – zmnožený PCR produkt sa vloží do bakteriálneho plazmidu (vektora) za účelom tvorby rekombinantnej DNA
• produkcia rekombinantných proteínov – pripravený PCR produkt slúži bunkovým továrňam (baktériám alebo kvasinkám) na masovú syntézu farmaceuticky dôležitých látok, ako je napríklad ľudský inzulín
• príprava na sekvenovanie – čisté PCR produkty slúžia ako nevyhnutný vstupný materiál pre čítanie sekvencie celých genómov