Hybridizácia nukleových kyselín

Kým neexistovali techniky molekulárnej biológie, v mnohých prípadoch, ktoré sa týkali najmä identifikácie osôb a určovania otcovstva, sa spoliehalo len na testovanie krvných skupín. To síce umožnilo vylúčiť určité osoby spomedzi ostatných "podozrivých", potvrdiť však jednu konkrétnu osobu je možné len využitím testu DNA a zostavením tzv. DNA profilu (angl. DNA profiling, DNA typing, DNA fingerprinting).

Schopnosť nukleových kyselín vytvárať dvojvláknové reťazce z jednovláknových molekúl na základe komplementarity báz je podstatou reprodukovateľnosti živej hmoty v prírode. Na základe komplementarity báz sa replikuje DNA (pomocou enzýmu DNA-polymerázy) a taktiež sa DNA v procese transkripcie prepisuje do RNA (pomocou enzýmu RNA-polymerázy). Princípom hybridizácie nukleových kyselín je komplementarita dvoch jednovláknových molekúl DNA/DNA, RNA/RNA alebo DNA/RNA, z ktorých kratšia molekula vystupuje ako sonda (próba), ktorá sa na základe komplementarity báz buď páruje alebo nepáruje s testovanou vzorkou DNA (alebo RNA).

Hybridizácia nukleových kyselín predstavuje jeden z najpoužívanejších nástrojov molekulárnej biológie. Má široké využitie v riešení mnohých problémov:

  • umožňuje populačným genetikom analyzovať genetickú variabilitu populácií a rôznych etnických skupín,
  • je účinným a právne zakotveným nástrojom jednoznačnej identifikácie osôb v kriminalistike,
  • využíva sa na zisťovanie otcovstva - paternity - v sporných prípadoch,
  • šľachtiteľom pomáha v identifikácii čistých zvieracích línií (psy, kone),
  • dokáže rozlíšiť "prirodzené" organizmy od geneticky modifikovaných (GM) organizmov,
  • uľahčuje liečbu bakteriálnych a vírusových ochorení presnou detekciou konkrétnych patogénnych kmeňov, a pod.

Denaturácia a renaturácia DNA

Vplyvom vysokých teplôt dochádza k rozpletaniu dvojvláknovej DNA, pričom vznikajú oddelené jednovláknové reťazce. Tento proces nazývame denaturáciou DNA. Opačný proces, kedy na základe komplementarity báz dochádza k spájaniu jednovláknových reťazcov, nazývame renaturáciou DNA. Tieto procesy zohrávajú kľúčovú úlohu v technikách využívajúcich hybridizáciu DNA.

DNA sa denaturuje aj pôsobením hydroxidu sodného (NaOH). Dvojvláknovú RNA možno denaturovať pôsobením formaldehydu (CH2O, metanál).
Denaturácia proteínov predstavuje teplotné alebo chemické porušenie terciárnej a sekundárnej štruktúry následkom čoho vzniká lineárny polypeptid, ktorý stráca funkciu pôvodného proteínu. Vo svojej podstate sa tak denaturácia nukleových kyselín a proteínov dosť odlišuje.

Hybridizačné próby

Základom hybridizačnej techniky je značená molekula jednovláknovej nukleovej kyseliny, tzv. hybridizačná sonda (próba), ktorá sa používa na detekciu príbuzných molekúl DNA alebo RNA. Táto sonda rozlišuje v zmesi nukleových kyselín len také molekuly, ktoré sú k nej komplementárne a zviditeľňuje (vizualizuje) ich.

Použitím rôznych podmienok hybridizácie (nižšia teplota, vyššia koncentrácia solí) možno detegovať aj také molekuly v testovanej zmesi, ktoré nie sú úplne komplementárne s použitou próbou. Táto vlastnosť sa nazýva stringencia, čiže presnosť hybridizácie. Čím vyššia stringencia (blízka 100%), tým sa sekvencia testovanej nukleovej kyseliny viac približuje sekvencii próby. Podmienky nižšej stringencie sa využívajú napr. pri detekcii neznámych, ale príbuzných sekvencií DNA u rôznych systematických druhov (napr. myš a človek), ktoré kódujú funkčne podobné bielkoviny, ale počas evolúcie sa ich sekvencia na úrovni DNA mierne odlíšila.

Značenie DNA

Aby hybridizačná sonda dokázala danú sekvenciu DNA zviditeľniť v zmesi ostatných molekúl, musí byť nejakým spôsobom označená.

Rádioaktívne značenie DNA

Rádioaktívne (izotopovo) značená DNA sa vizualizuje pomocou röntgenových (RTG) lúčov, pričom výsledkom je obraz nazývaný autorádiograf.

Rádioaktívne značenie DNA využíva napr. Southernova hybridizácia. Pri rádioaktívnom značení DNA sa najprv fragmenty DNA vzorky elektroforeticky separujú podľa veľkosti (v tejto fáze nie sú na géli viditeľné žiadne prúžky). Potom sa na gél pôsobí roztokom obsahujúcim rádioaktívne značenú hybridizačnú próbu. Tá hybridizuje len k tým fragmentom, ku ktorým je sekvenčne komplementárna, takže po vystavení gélu röntgenovým lúčom "zasvietia" len niektoré prúžky. (Poznámka: Roztok obsahuje aj špecifické próby k fragmentom štandardov molekulových hmotností alebo je marker už vopred značený, ale pre pochopenie princípu značenia vzoriek to nie je dôležité.)

Nerádioaktívne značenie DNA

Nerádioaktívne (neizotopové) značenie spočíva najčastejšie v použití fluoreskujúcich farebných značiek - fluorochrómov (fluorofórov), ktoré sú bezpečnejšie (nie sú rádioaktívne), avšak menej citlivé pre veľmi malé množstvá DNA. Farbička sa kovalentne viaže na nukleotidy próby a k jej vizualizácii je potrebný fluorescenčný mikroskop.

Princíp fluorescencie chemických látok je v ich schopnosti pohlcovať elektromagnetické žiarenie určitej vlnovej dĺžky (napr. modré svetlo) a následne vydávať žiarenie inej vlnovej dĺžky (napr. zelené svetlo). Fluorescenčný mikroskop je upravený svetelný mikroskop, ktorý pomocou špeciálneho filtra ožaruje pozorovaný materiál žiarením, ktoré v ňom excituje molekuly fluorochrómu, preto sa toto žiarenie nazýva excitačné žiarenie a filter je excitačný filter. Excitačné žiarenie dodáva elektrónom fluorochrómu energiu, ktorá im umožní prechod na energeticky vyšší orbital. To však trvá len krátko, elektróny sa vrátia naspäť na energeticky výhodnejší orbital, pričom vyžiaria energiu v podobe emisného žiarenia, ktoré má nižšiu energiu, a teda väčšiu vlnovú dĺžku. Emisné žiarenie prechádza cez emisný filter mikroskopu, a tým sa fluoreskujúci predmet vizualizuje. Dôležitou súčasťou fluorescenčného mikroskopu je dichroické zrkadlo, ktorého vlastnosťou je, že odráža a smeruje excitačné žiarenie s nižšou vlnovou dĺžkou na sledovaný predmet a prepúšťa emisné žiarenie s vyššou vlnovou dĺžkou do okulára.

Etídiumbromid (EtBr) je tiež fluorochróm, ktorý sa excituje ultrafialovým svetlom s vlnovou dĺžkou 254 nm, pričom emituje žiarenie vo viditeľnom spektre v oblasti oranžového svetla, ktoré má vlnovú dĺžku 605 nm, preto prúžky DNA na elektroforetickom géli vystavené UV žiareniu po farbení EtBr svietia oranžovo.

Pri vizualizácii možno použiť niekoľko odlišne značených prób (odlišné farbičky) a vytvárať tak viacfarebné obrázky. Fluorofóry pokrývajú celé viditeľné emisné spektrum. (Údaje v tabuľke sú podľa Chrombios Molecular Cytogenetics.)

Tab. Fluorofóry
farbaoznačenie
fluorofóru
max. vlnová dĺžka
excitačného žiarenia
max. vlnová dĺžka
emisného žiarenia
modráDAPI358461
tyrkysováDEAC426480
zelenáFITC/R110494 / 500517 / 525
žltáR6G524550
oranžováTAMRA/Cy3552 / 550575 / 570
červenáTexRed/Cy3.5590 / 581612 / 596
blízko infračervenéCy5649670
infračervenéCy5.5675694

Molekulárne metódy založené na hybridizácii DNA

Najviac popisované sú 3 metódy založené na hybridizácii DNA, ktoré sú pekným príkladom využitia rádio- aj nerádioaktívne značených prób:

  • Southernova hybridizácia - využíva rádioaktívne značenie
  • FISH (fluorescenčná in situ hybridizácia) - využíva nerádioaktívne značenie
  • DNA čipy - využívajú nerádioaktívne značenie

Southernova hybridizácia

Southernova hybridizácia (Southernov blotting, skrátene Southern blot) je metóda, ktorú prvýkrát použil britský biológ EDWIN SOUTHERN (nar. 1938) v roku 1975 na detekciu príbuzných sekvencií v zmesi nukleových kyselín.

Princíp

Metóda využíva niekoľko po sebe nasledujúcich postupov:

  1. štiepenie DNA restrikčnými endonukleázami,
  2. elektroforetickú separáciu zmesi fragmentov DNA,
  3. prenos fragmentov DNA na nylonovú alebo nitrocelulózovú membránu ("blotting"),
  4. hybridizáciu rádioaktívne značených prób.

Kvôli lepšiemu pochopeniu postupu a celkového významu tejto metódy uvediem príklad využitia Southern blotu na identifikáciu osôb. Dve nepríbuzné osoby majú odlišnú sekvenciu DNA, takže u nich budú restrikčné endonukleázy štiepiť molekulu DNA na rôznych miestach, čím budú vznikať aj rôzne dlhé fragmenty. Porovnanie DNA profilu na elektroforetickom géli je však prakticky úplne nemožné, pretože množstvo fragmentov je veľmi veľké. Využitím rádioaktívne značených hybridizačných prób sa snažíme redukovať množstvo hodnotených fragmentov a porovnaním dvoch profilov DNA určiť tak ich zhodu.

Pri porovnávacej analýze dvoch vzoriek môže nastať niekoľko prípadov:

  1. próba kvôli nepríbuznej sekvencii s cieľovou sekvenciou DNA vôbec nehybridizuje,
  2. próba s cieľovou DNA síce hybridizuje, ale v dôsledku odlišných pozícií restrikčných miest v DNA dvoch rôznych vzoriek sú vzniknuté fragmenty DNA rôzne dlhé, a teda sa po elektroforetickej separácii nachádzajú v odlišnej vzdialenosti od seba,
  3. ak sú vzorky DNA totožné, po štiepení restrikčnými endonukleázami vzniknú rovnako veľké fragmenty DNA, takže vizualizované prúžky z dvoch vzoriek (dráh) budú videné v rovnakých vzdialenostiach od začiatku gélu.

Podľa použitých restrikčných endonukleáz a prób vzniká rôzne množstvo jedinečných prúžkov, ktoré možno hodnotiť. Pre objektívne hodnotenie profilu DNA pomocou Southernovej hybridizácie je potrebné vybrať optimálne množstvo prúžkov (nie príliš veľa ale ani málo). Žiadna identifikácia nie je pozitívna, ak sa v porovnávaných dráhach nezhodujú všetky (100%) prúžky! Metóda Southern blot je veľmi citlivá, pretože dokáže identifikovať aj stopové množstvo DNA, avšak časovo je tento proces veľmi náročný (7-14 dní).

Technický postup

Postup Southernovej hybridizácie je v skratke nasledovný:

  1. Najprv sa cieľová (testovaná) DNA štiepi restrikčnými endonukleázami, ktoré vytvoria rôzne dlhé fragmenty DNA.
  2. Tieto fragmenty sa separujú napr. pomocou agarózovej elektroforézy.
  3. Použije sa NaOH na denaturáciu dvojvláknovej DNA, čo uľahčuje naviazanie na membránu (krok 4) a umožňuje hybridizáciu so značenou(ými) próbou(ami).
  4. Zostaví sa samotná aparatúra pre prenos ("blotting") fragmentov DNA z gélu na membránu. Na gél sa položia v tomto poradí nasledovné veci:
    1. nitrocelulózová alebo nylonová membrána (zachytáva sa tu jednovláknová DNA, pričom vzniká presný "odliatok" gélu, tzn. rozmiestnenie prúžkov sa nemení)
    2. filtračný papier (odsáva blotovací pufor, pričom sa tento tlak využije aj na "vyťahovanie" DNA z gélu, ktorá sa zachytáva na membráne)
    3. závažie
  5. Membrána sa zapečie pri teplote 60-100°C, čo spôsobí trvalé prichytenie jednovláknovej DNA na membránu.
  6. Membrána sa ponorí do roztoku obsahujúcom rádioaktívne značené próby. Tie na základe komplementarity hybridizujú s jednovláknovými fragmentami DNA na membráne. Membrána sa premyje v premývacom roztoku, ktorý odstráni nadbytočné, nešpecificky naviazané alebo nenaviazané próby.
  7. Pomocou röntgenových (RTG) lúčov sa vyhotoví autorádiograf a porovná sa DNA profil v jednotlivých dráhach.

Northernova hybridizácia

Pomenovanie tejto techniky je trošku hra so slovíčkami, pretože vyjadruje príbuznú techniku hybridizácie molekúl ako v prípade Southernovej hybridizácie, ale ako cieľová nukleová kyselina sa analyzuje RNA. Northernova hybridizácia (northern blotting) sa teda používa najmä na analýzu génovej expresie (transkripčného profilu), pretože sa analyzuje mRNA ako dôsledok transkripcie génov. Ako v prípade porovnávanie profilu DNA s využitím Southernovej hybridizácie, tak aj northernova hybridizácia sa používa na porovnanie profilov - génovej expresie, napr. zisťujú sa rozdiely v expresii génov rôznych bunkových typov alebo sa zisťuje transkripčný profil bunkových génov pred a po vírusovej infekcii a pod.

Materiálom pre northernovu hybridizáciu je teda RNA, ktorá sa izoluje z príslušného tkaniva (napr. mozgové a pečeňové bunky, bunky v rôznom štádiu bunkového cyklu a pod.). Niekedy sa hodí priama izolácia molekúl mRNA pomocou tzv. oligo-dT nosičov. Následne sa podobne ako pri Southernovej hybridizácii molekuly RNA elektroforeticky separujú a po prenose na membránu sa hybridizujú so značenými próbami, ktorými môžu byť molekuly RNA alebo aj DNA.

FISH

FISH (fluorescent in situ hybridization) je cytogenetická technika, ktorá je založená na hybridizácii prób k chromozomálnej DNA denaturovanej priamo na mieste (t.j. in situ) podložného sklíčka s využitím fluorescenčného značenia. Výsledný obrázok sa vizualizuje použitím fluorescenčného mikroskopu. Metódu možno použiť na metafázne chromozómy, ale aj na interfázne jadro (technika nazývaná aj DNA fiber-FISH; angl. fiber = vlákno). Pomocou FISH možno jednoznačne charakterizovať a zatriediť každý ľudský chromozóm do karyotypu, odhaľovať chromozómové aberácie a z nich vyplývajúce genetické choroby ako aj mapovať pozície jednotlivých génov na chromozóme.

DNA čipy

Metóda DNA čipov (angl. DNA microarrays) umožňuje vo vzorke detegovať naraz veľké množstvo špecifických sekvencií DNA a taktiež určovať hladinu expresie génov (stanovenie množstva transkriptov RNA). V princípe pozostáva DNA čip zo sklenenej podložky, na ktorej sú imobilizované jednovláknové próby známej sekvencie. Môžu byť nimi aj celé gény. Keďže sa táto technika používa, podobne ako northernova hybridizácia, na detekciu rôznej hladiny expresie dvoch bunkových línií, materiálom pre analýzu je RNA. Výhodou tejto techniky je, že nevyžaduje elektroforetickú separáciu molekúl, ale porovnanie transkripčného profilu vychádza z rozdielov dvoch odlišne farebne značených vzoriek, ktoré sa vyhodnocujú počítačovo.

Meranie hladiny expresie dvoch bunkových línií (napr. normálne a rakovinové tkanivo) prebieha nasledovne: Z oboch bunkových línií sa izoluje celková mRNA, ktorá sa prepíše do komplementárnej DNA (cDNA) pomocou reverznej transkriptázy. Získame tým kolekciu jednovláknových sekvencií DNA exprimovaných génov z oboch bunkových línií. Jednu aj druhú vzorku označíme rôznymi fluorescenčnými farbičkami (DNA z normálneho tkaniva zelenou, DNA z rakovinového tkaniva červenou). Rozdiel oproti predchádzajúcim popísaným technikám hybridizácie je v tom, že tentokrát sú fluorescenčne značené nie próby, ale testované vzorky. Obidve vzorky zmiešame a nalejeme na DNA čip, kde prebehne hybridizácia. Deteguje sa výsledná fluorescencia na každej próbe zvlášť spôsobom, ktorý je vysvetlený v tabuľke:

Tab. Možné výsledky hybridizácie na DNA čipe
farbahybridizáciazáver
čiernažiadna cieľová sekvencia DNA nehybridizovala so známou próbou (na čipe)ani normálna bunková línia, ani rakovinová neexprimuje daný gén (tým je próba na čipe)
zelenás próbou hybridizovala len sekvencia z normálnej bunkovej línierakovinové tkanivo daný gén neexprimuje, normálne tkanivo áno
červenás próbou hybridizovala len DNA z rakovinovej bunkovej líniedaný gén exprimuje len nádorové tkanivo ale nie normálne tkanivo
žltás próbou hybridizovala DNA z obidvoch bunkových línií približne v rovnakom množstve obe línie exprimujú daný gén v rovnakej hladine (zelená + červená = žltá)
rôzne odtiene žltej, zelenej a červenejs próbou hybridizovala DNA z obidvoch línií ale s prevahou určitej cieľovej sekvenciestupeň expresie génu normálnej a nádorovej línie sa odlišuje

Najprv sa izoluje z dvoch bunkových línií, ktorých expresiu génov chceme porovnať, celková mRNA. Tá sa enzýmom reverzná transkriptáza prepíše do jednovláknovej DNA. DNA obidvoch vzoriek sa označí rôznymi fluorescenčnými farbičkami. Obidve vzorky sa následne zmiešajú v koncentrácii 1:1 a nalejú sa na DNA čip. Čip obsahuje imobilizované jednovláknové próby (gény) zobrazené čiernou (bez farebnej guličky). Napokon sa spektrofotometricky meria emisná vlnová dĺžka z jednotlivých plôšok, ktorá je (v konečnom dôsledku) funkciou génovej expresie vzoriek 1 a 2.

DNA profil z čipov môže pozostávať zo 100 až 1000 génov a veľkého množstva farebných odtieňov, takže výsledok je ponechaný kompletne na počítač, ktorý pomocou laserového snímača meria intenzitu zafarbenia a vyhodnocuje výslednú hybridizáciu ako mieru expresie pre každý gén (próbu) (proces nazývaný angl. data mining = doslova "dolovanie" údajov).