Kvantifikácia proteínov (stanovenie celkovej koncentrácie bielkovín vo vzorke) patrí medzi najzákladnejšie a najdôležitejšie laboratórne operácie v biochémii, molekulárnej biológii a klinickej diagnostike. Presná znalosť koncentrácie bielkovín je nevyhnutným odrazovým mostíkom pred ďalšou analýzou vzoriek, napríklad pred nanesením vzorky na gélovú elektroforézu (SDS-PAGE) a následný western blot, kde musíme do všetkých jamiek naniesť rovnaké množstvo proteínu, aby výsledky boli porovnateľné.
Väčšina bežných kvantifikačných metód je spektrofotometrických – sú založené na meraní absorbancie (miera pohlcovania svetla vzorkou) pri špecifickej vlnovej dĺžke. Keďže proteíny sú v bežnom tlmivom roztoku (pufri) bezfarebné, pridávame k nim špeciálne chemické činidlá. Tieto činidlá špecificky reagujú s peptidovou kostrou alebo konkrétnymi aminokyselinami, čo vedie k vzniku farebného komplexu. Intenzita výsledného sfarbenia je priamo úmerná množstvu proteínov a meria sa pomocou spektrofotometra.
Prehľad hlavných analytických metód link
V závislosti od koncentrácie proteínov vo vzorke, prítomnosti rušivých látok a požadovanej rýchlosti analýzy volíme v laboratóriu rôzne metodické prístupy:
- Kjeldahlova metóda – historická, no veľmi presná technika fungujúca na princípe stanovenia organického dusíka
- Biuretová metóda – využíva reakciu meďnatých katiónov s dusíkmi v peptidových väzbách
- Lowryho metóda – kombinuje biuretovú reakciu s Folin-Ciocalteauovým činidlom
- BCA metóda – využíva redukciu medi a následnú chelatáciu
- Bradfordova metóda – založená na nekovalentnej väzbe kyslého organického farbiva na proteíny
- Pierce 660 nm – pracuje v kyslom prostredí a využíva väzbu prechodného kovu s komplexom farbiva
| Metóda | Použité hlavné činidlá | Meraná vlnová dĺžka | Detekčný limit (citlivosť) | Hlavné výhody | Hlavné obmedzenia a interferencie |
|---|---|---|---|---|---|
| Kjeldahlova | H₂SO₄, katalyzátor (CuSO₄), NaOH | Titrácia (objem činidla) | Vysoká (referenčná metóda) | Extrémne presná, nezávisí od aminokyselinového zloženia. | Veľmi zdĺhavá, nebezpečné chemikálie, vysoké teploty. |
| Biuretová | CuSO₄, NaOH, vínan sodno-draselný | 540 nm | Nízka (od 1 g/l) | Jednoduchá, lacná, stabilná, minimálne interferencie. | Nevhodná pre moč/likvor (nízka citlivosť), interferuje s amoniakom a lipidmi. |
| Lowryho | Cu²⁺, Folin-Ciocalteauovo činidlo | 750 nm | Vysoká (približne od 5 μg/ml) | Veľmi vysoká citlivosť (100-krát vyššia než biuret). | Extrémne náchylná na interferencie s bežnými laboratórnymi látkami. |
| BCA | Kyselina bicinchonínová, CuSO₄ | 562 nm | Vysoká (0,125 – 2,0 mg/ml) | Tolerantná voči detergentom (SDS, Triton), veľmi stabilná. | Závisí od prítomnosti špecifických aminokyselín (Cys, Tyr, Trp), dlhšia inkubácia. |
| Bradfordova | Coomassie Brilliant Blue G-250, kyselina | 595 nm | Veľmi vysoká (rýchla mikrometóda) | Veľmi rýchla (do 2 min), citlivá, lacná. | Nekompatibilná s detergentmi (zrážanie farbiva), vysoká variabilita podľa typu proteínu. |
| Pierce 660 nm | Farbivo-kovový komplex v kyslom prostredí | 660 nm | Veľmi vysoká | Rýchla, citlivá, vysoko odolná voči detergentom. | Vyžaduje špeciálne patentované komerčné činidlo. |
Kjeldahlova metóda link
Kjeldahlova metóda predstavuje klasickú referenčnú analytickú techniku určenú na stanovenie celkového množstva bielkovín na základe kvantifikácie organicky viazaného dusíka. Vyvinul je dánsky chemik JOHAN KJELDAHL v roku 1883, kedy pôsobil ako riaditeľ chemického oddelenia v laboratóriách pivovaru Carlsberg. Hľadal spoľahlivý spôsob, ako stanoviť presný obsah bielkovín v jačmeni na varenie piva.
Metóda je založená na predpoklade, že proteíny obsahujú v priemere 16 % dusíka, čo umožňuje spätne prepočítať hmotnosť stanoveného dusíka na celkovú hmotnosť bielkovín.
Princíp a chemický postup link
Analýza prebieha v troch po sebe nasledujúcich fázach:
- mineralizácia – biologická vzorka sa najprv zbaví nebielkovinných dusíkatých zlúčenín (napr. vyzrážaním proteínov pomocou kyseliny trichlóroctovej – TCA). Následne sa vzorka zahrieva na teplotu 340 °C až 360 °C v koncentrovanej kyseline sírovej (H₂SO₄) za prítomnosti katalyzátora (najčastejšie síranu meďnatého – CuSO₄). Počas tohto procesu sa organická hmota kompletne zoxiduje na oxid uhličitý a vodu, zatiaľ čo prítomný dusík sa premení na anorganickú soľ – síran amónny.
- alkalizácia a destilácia – k roztoku síranu amónneho sa pridá silná zásada – hydroxid sodný (NaOH). Týmto krokom sa z amónnych iónov vytesní plynný amoniak (NH₃): \( (NH_4)_2SO_4 + 2 NaOH \rightarrow Na_2SO_4 + 2 NH_3 \uparrow + 2 H_2O \) a spolu s vodnou parou sa predestiluje cez chladič do zbernej nádoby, ktorá obsahuje nadbytok kyseliny boritej (H₃BO₃). Amoniak reaguje so slabou kyselinou boritou v stechiometrickom pomere 1:1 za vzniku boritanu amónneho, čím sa plyn bezpečne zafixuje v roztoku vo forme neprchavých iónov: \( NH_3 + H_3BO_3 \rightarrow NH_4^+ + H_2BO_3^- \)
- titrácia – absorpciou zásaditého amoniaku slabo kyslý roztok kyseliny boritej zmení svoje pH smerom do alkalickej oblasti v dôsledku akumulácie boritanových aniónov (H₂BO₃⁻). Množstvo vzniknutého boritanu, ktoré presne zodpovedá množstvu zachyteného amoniaku, sa stanoví priamou acidobázickou titráciou. Roztok sa titruje roztokom silnej kyseliny známej koncentrácie (najčastejšie kyseliny chlorovodíkovej – HCl), kým sa pH nevráti na pôvodnú hodnotu: \( H_2BO_3^- + H^+ \rightarrow H_3BO_3 \) Spotrebovaný objem roztoku kyseliny sa zaznamená a použije na výpočet koncentrácie dusíka.
Farebné prechody link
Na presnú vizuálnu detekciu tzv. bodu ekvivalencie (okamihu úplnej neutralizácie boritanových iónov) sa do kyseliny boritej pridáva zmiešaný Tashirov indikátor (zmes acidobázického indikátora metylovej červene a kontrastného farbiva metylénovej modrej). Zmeny sfarbenia prebiehajú v závislosti od pH nasledovne:
- východiskový stav (pred destiláciou) – v zbernej banke je prítomná len čistá kyselina boritá (pH ~ 4,8). Roztok vykazuje červeno-fialové sfarbenie
- stav po destilácii – po zachytení amoniaku a vzniku boritanových iónov pH roztoku stúpne nad hodnotu 8. Indikátor mení sfarbenie na jasne zelené
- priebeh titrácie – počas pridávania odmerného roztoku HCl zelené sfarbenie postupne bledne a prechádza cez neutrálny sivý odtieň (prechodná farba indikátora)
- bod ekvivalencie (koniec titrácie) – prídavkom poslednej ekvivalentnej kvapky HCl sa roztok v sekunde prefarbí späť do červeno-fialovej farby. V tomto okamihu sa titrácia okamžite ukončuje a odčíta sa spotreba HCl.
Matematické vyhodnotenie link
Z nameraného spotrebovaného objemu kyseliny chlorovodíkovej sa vypočíta celková hmotnosť bielkovín podľa vzťahu:
\( m_{\text{bielkovín}} = V_{\text{HCl}} \times c_{\text{HCl}} \times M_{\text{N}} \times f_{\text{Kjeldahl}} \)
- \( V_{\text{HCl}} \) – spotrebovaný objem odmerného roztoku HCl vyjadrený v litroch
- \( c_{\text{HCl}} \) – presná látková koncentrácia odmerného roztoku HCl v mol/l
- \( M_{\text{N}} \) (14,007 g/mol) – molárna hmotnosť dusíka, slúžiaca na prepočet látkového množstva na hmotnosť dusíka v gramoch
- \( f_{\text{Kjeldahl}} \) (6,25) – empirický prepočítací koeficient (faktor). Vychádza z predpokladu, že proteíny obsahujú priemerne 16 % dusíka (100 / 16 = 6,25). Vynásobením hmotnosti dusíka týmto faktorom získame celkovú hmotnosť bielkovín vo vzorke.
Využitie a limity link
Ide o klasickú referenčnú metódu vysokej presnosti, podľa ktorej sa kalibrujú ostatné postupy. V bežných laboratóriách sa však už pre rutinné merania nepoužíva, nakoľko je technicky a časovo náročná a vyžaduje manipuláciu s horúcimi koncentrovanými kyselinami.
Biuretová metóda link
Biuretová metóda je najpoužívanejšou metódou na stanovenie celkovej koncentrácie bielkovín v krvnom sére. Názov dostala podľa biuretu (jednoduchá organická látka vznikajúca kondenzáciou dvoch molekúl močoviny), ktorý poskytuje rovnakú chemickú reakciu. Metódu prvýkrát opísal nemecký chemik FERDINAND ROSE v roku 1883, no pre klinické stanovenie bielkovín z ľudských odberov ju rozpracovali do dnešnej podoby až vedci v 40. rokoch 20. storočia.
Princíp a zloženie biuretového činidla link
Reakcia prebieha výhradne v silne alkalickom (zásaditom) prostredí. Meďnaté katióny (Cu²⁺) reagujú s dusíkmi v peptidových väzbách (chemické väzby −CO−NH−, ktoré spájajú jednotlivé aminokyseliny v bielkovinovom reťazci). Jeden ión medi (Cu²⁺) vytvorí koordinačný (chelátový) komplex so štyrmi až šiestimi susednými peptidovými väzbami, čo sa prejaví vznikom charakteristického červenofialového zafarbenia.
Biuretové činidlo je stabilné jednofľaškové činidlo obsahuje štyri kľúčové zložky:
- síran meďnatý (CuSO₄) – poskytuje meďnaté ióny (Cu²⁺) pre vznik farebného komplexu
- hydroxid sodný (NaOH) – zabezpečuje silne alkalické prostredie nevyhnutné pre deprotonizáciu dusíkov peptidovej väzby
- vinan sodno-draselný – zabraňuje nežiaducemu zrážaniu meďnatých iónov na nerozpustný hydroxid meďnatý [Cu(OH)₂] v zásaditom prostredí
- jodid draselný (KI) – pôsobí ako antioxidant a bráni autoredukcii (samovoľnej premene) meďnatých iónov (Cu²⁺) na meďné ióny (Cu⁺)
Príprava reakčnej zmesi link
V analytickej a klinickej praxi sa najčastejšie využíva makrometóda v skúmavkách. Pripraví sa séria skúmaviek pre slepú vzorku (blank), štandard (kalibrátor) a neznáme vzorky séra.
| Skúmavka | Vzorka / Štandard (Objem) | Biuretové činidlo (Objem) |
|---|---|---|
| Blank (slepá vzorka) | 100 µl destilovanej vody (alebo fyziologického roztoku) | 5,0 ml |
| Štandard (BSA / Kalibrátor) | 100 µl kalibračného roztoku (napr. BSA s koncentráciou 60 g/l) | 5,0 ml |
| Neznáma vzorka (sérum) | 100 µl analyzovaného séra | 5,0 ml |
Laboratórny postup link
Postup biuretovej metódy prebieha v týchto krokoch:
- dávkovanie – do označených skúmaviek sa najprv napipetuje príslušný objem vzorky, kalibrátora alebo vody (100 µl)
- pridanie činidla – do všetkých skúmaviek sa pridá Biuretové činidlo (5,0 ml)
- homogenizácia – obsah skúmaviek sa okamžite dôkladne premieša pomocou vortexu (vibračnej miešačky)
- inkubácia – skúmavky sa ponechajú inkubovať 30 minút pri laboratórnej teplote (15–25 °C) v tme. Pre urýchlenie chemickej reakcie je možné zvoliť inkubáciu počas 10 minút vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C.
- fotometria – zmeria sa absorbancia (miera pohlcovania svetla) štandardov a neznámych vzoriek pri vlnovej dĺžke 540 nm proti slepej vzorke (blanku). Vzniknuté červenofialové sfarbenie komplexu je stabilné niekoľko hodín.
Matematické vyhodnotenie link
Biuretová reakcia vykazuje prísnu linearitu (platnosť Lambertovho-Beerovho zákona) v celom rozsahu fyziologických aj patologických koncentrácií bielkovín v sére (približne od 10 do 100 g/l). Preto pri rutinnom stanovení v klinickej diagnostike postačuje porovnanie s jedným štandardom s presne známou koncentráciou:
\( c_{\text{vzorky}} = \frac{A_{\text{vzorky}}}{A_{\text{štandard}}} \times c_{\text{štandard}} \)
- \( c_{\text{vzorky}} \) – výsledná koncentrácia proteínov v analyzovanej vzorke (v g/l)
- \( c_{\text{štandard}} \) – presná koncentrácia použitého kalibrátora (napr. 60 g/l)
- \( A_{\text{vzorky}} \) – nameraná absorbancia neznámej vzorky pri 540 nm po odpočítaní absorbancie blanku
- \( A_{\text{štandard}} \) – nameraná absorbancia štandardu pri 540 nm po odpočítaní absorbancie blanku
Limity a rušivé vplyvy link
Limity spočívajú v tom, že aby látka reagovala s biuretovým činidlom, musí obsahovať aspoň dve peptidové väzby. Voľné aminokyseliny ani dipeptidy s činidlom nereagujú. Metóda je relatívne málo citlivá – spoľahlivo meria až od koncentrácie 1 g/l (= 1 mg/ml) bielkovín. Preto je úplne nevhodná na stanovenie proteínov v moči alebo v mozgovomiechovom moku (likvore), kde sú fyziologické koncentrácie bielkovín omnoho nižšie.
Meranie môžu falošne zvyšovať chylózne (zakalené tukom), hemolytické (obsahujúce červené farbivo z rozpadnutých erytrocytov) či ikterické (žltačkové séra s vysokým bilirubínom) vzorky. Falošne negatívne (nízke) hodnoty zasa vznikajú vo vzorkách s vysokou koncentráciou amoniaku, pretože amónne ióny konkurujú meďnatým pri tvorbe komplexu.
Lowryho metóda link
Lowryho metóda bola vyvinutá s cieľom zvýšiť citlivosť stanovenia proteínov pre potreby merania ich nízkych koncentrácií. Predstavil ju americký biochemik OLIVER H. LOWRY v roku 1951.
Laboratórny postup link
Kombinuje dva samostatné chemické kroky:
- prvý krok – reakcia proteínu s meďnatými iónmi (Cu²⁺) v alkalickom prostredí za vzniku koordinačného komplexu medi s peptidovou kostrou bielkoviny
- druhý krok – do reakčnej zmesi sa pridá Folin-Ciocalteauovo činidlo (špeciálna žltá zmes kyseliny fosfomolybdénovej a kyseliny fosfowolfrámovej). Prítomné aromatické aminokyseliny tyrozín a tryptofán (obsahujúce benzénové jadro) v spolupráci s vytvoreným komplexom medi zredukujú toto činidlo, čím vzniká intenzívne tmavomodrý komplex.
Absorbancia tohto modrého komplexu sa meria pri vlnovej dĺžke 750 nm.
Limity a rušivé vplyvy link
Lowryho metóda zvyšuje citlivosť stanovenia proteínov približne 100-krát v porovnaní s biuretovou reakciou až na hodnotu 0,01 mg/ml (= 10 µg/ml). Hoci v prvom kroku zostáva roztok kvôli nízkej koncentrácii proteínov bezfarebný, Folinovo činidlo v druhom kroku funguje ako chemický zosilňovač, ktorý túto neviditeľnú zmenu dofarbí do modra.
Jej najväčšou slabinou je však veľmi vysoká citlivosť na interferencie (rušivé vplyvy). Veľké množstvo bežných laboratórnych chemikálií (detergenty, sacharidy, niektoré aminokyseliny a pufre) reaguje s Folin-Ciocalteauovým činidlom a spôsobuje nepresné, falošne pozitívne výsledky.
BCA metóda link
BCA metóda (angl. Bicinchoninic Acid) je modernou, vysoko stabilnou a populárnou alternatívou k Lowryho metóde, pričom s ňou zdieľa prvú časť mechanizmu (reakciu proteínu s meďnatými iónmi v alkalickom prostredí). Prvýkrát ju predstavil chemik PAUL K. SMITH so svojím tímom v roku 1985, keď hľadal robustnú alternatívu k Lowryho metóde, ktorá by bola odolná voči vplyvu detergentov.
Princíp a laboratórny postup link
Reakcia prebieha v dvoch krokoch:
- redukcia medi – v alkalickom prostredí reagujú meďnaté ióny (Cu²⁺) s peptidovou kostrou proteínu za vzniku koordinačného komplexu, v ktorom dochádza k redukcii Cu²⁺ na meďné ióny (Cu⁺). Miera tejto redukcie závisí od peptidovej kostry a prítomnosti štyroch konkrétnych aminokyselín – cysteínu, cystínu, tryptofánu a tyrozínu.
- chelatácia s BCA – uvoľnené meďné ióny (Cu⁺) špecificky a selektívne zreagujú s kyselinou bicinchonínovou (BCA, ktorá má v nespojenom stave zelenú farbu). Dve molekuly BCA obklopia jeden ión Cu⁺ (vytvoria chelát), čo vedie k vzniku intenzívneho fialového komplexu rozpustného vo vode.
Fialový komplex vykazuje silnú lineárnu absorbanciu pri vlnovej dĺžke 562 nm (reálne merateľnú v rozsahu 550–570 nm).
Výhody link
Na rozdiel od Bradfordovej metódy je BCA metóda vysoko tolerantná voči detergentom (napr. SDS, Triton X-100), ktoré sa bežne používajú na lýzu (rozbitie) buniek pri príprave vzorky. Zároveň poskytuje stabilnejší farebný signál ako Lowryho metóda.
Bradfordova metóda link
Bradfordova metóda patrí k najrýchlejším a najcitlivejším kolorimetrickým metódam (založeným na meraní intenzity zafarbenia vzorky) v molekulárnej biológii. Na rozdiel od predchádzajúcich troch metód nevyužíva meď ani redoxné reakcie. Metódu vynašiel americký vedec MARION McKINLEY BRADFORD v roku 1976.
Často sa v našich textoch vyskytuje chybná informácia, že Dr. Bradford(ová) (1946–2021) bola žena. Vyplýva to z dvoch vecí: 1. v anglických textoch nie je rod osoby známy dovtedy, kým sa v ňom vyslovene nenapíše „he/she”, čo nie každý text pri tejto metóde spomína; 2. meno Marion je u nás známe jednoznačne ako ženské meno, no v anglosaských krajinách je v skutočnosti používané aj u mužov.
Princíp a laboratórny postup link
Princíp metódy spočíva na nekovalentnej (fyzikálnej) väzbe kyslého organického farbiva Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) priamo na proteíny v kyslom prostredí. Farbivo sa viaže primárne na bázické (kladne nabité, napr. arginín, lyzín) a aromatické aminokyseliny.
Voľné farbivo v silne kyslom prostredí existuje v katiónovej forme, ktorá má červenohnedé sfarbenie s maximom absorbancie pri 465 nm. Keď sa však záporne nabité molekuly farbiva naviažu na proteín, prejdú na stabilnú modrú aniónovú formu, čím sa ich absorpčné maximum posunie na 595 nm. Tento výrazný farebný prechod (tzv. posun absorpčného maxima) z hnedočervenej do jasne modrej je okamžite viditeľný voľným okom.
Absorbancia modrého komplexu sa meria pri 595 nm (bežne aj pri 590 nm) už po 2 až 5 minútach od zmiešania vzorky s činidlom.
Limity a nevýhody link
Metóda je veľmi rýchla, citlivá a lacná. Jej najväčšou slabinou je však vysoká miera interferencie s detergentmi (napr. SDS, Triton X-100, NP-40). Detergenty totiž kvôli svojej hydrofóbnej povahe priamo vytláčajú farbivo z väzobných miest na proteíne. Navyše už pri nízkych koncentráciách vytvárajú vo vode micely, ktoré voľné farbivo sami absorbujú a stabilizujú v jeho modrej (aniónovej) forme bez prítomnosti proteínu, čo spôsobuje falošne vysokú absorbanciu alebo vedie k okamžitému zrážaniu činidla a znehodnoteniu merania.
Metóda Pierce 660 nm link
Ide o modernú a vysoko robustnú metódu, ktorá odstraňuje hlavné nevýhody Bradfordovej (citlivosť na prítomné detergenty) aj BCA metódy (závislosť od aminokyselinového zloženia). Túto metódu vyvinul biochemik BABU ANTHARAVALLY s kolegami pre spoločnosť Pierce Biotechnology a patentovali/publikovali ju v roku 2009.
Princíp a laboratórny postup link
Pracuje sa v kyslom prostredí a využíva sa väzba špeciálneho prechodného kovu s komplexom tzv. polyhydroxybenzénsulfonftaleínového farbiva, pričom meranie, podobne ako v prípade Bradfordovej metódy, využíva posun absorpčného maxima medzi dvomi stavmi. Samotné činidlo (kov-farbivo) má červenohnedú farbu a absorpčné maximum pri 450 nm. Pri nízkom pH dochádza k deprotonizácii (odovzdaniu vodíkového iónu) farbiva, čo uľahčuje jeho interakciu s kladne nabitými aminokyselinami proteínu. Po naviazaní na proteín komplex zozelenie a jeho absorpčné maximum sa posunie na 660 nm.
Hlavné výhody link
Metóda je veľmi rýchla, vysoko citlivá a na rozdiel od Bradfordovej metódy je úplne odolná voči detergentom aj ďalším bežným aditívam v biologických vzorkách. Taktiež na rozdiel od BCA metódy sa hodí aj pre vzorky, ktoré majú v porovnaní s komerčným štandardom (najčastejšie BSA) netypické zloženie aminokyselín (najmä prítomnosť cysteínu, cystínu, tryptofánu a tyrozínu).
Rušivé vplyvy merania (Interferencie) link
V laboratórnej praxi sa bežne stretávame s postupom, ktorý pre uľahčenie izolácie proteínov z buniek vyžaduje napr. použitie detergentov (SDS, Triton X-100), pričom niektoré z použitých kvantifikačných metód sú týmto priamo ovplyvnené (spôsobujú falošne pozitívne alebo negatívne výsledky, tzn. nadhodnocujú alebo podhodnocujú meranie). Interferencie môžu spôsobovať aj niektoré organické zložky (napr. sacharidy alebo niektoré aminokyseliny), príp. zložky tlmivého roztoku (pufru).
Tieto problémy v princípe možno zmierniť týmito spôsobmi, no ich použitie alebo účinnosť môže závisieť od konkrétnej kvantifikačnej metódy:
- korekcia blankom („slepou vzorkou”) – na meranie pozadia sa použije čistý pufor bez proteínu a prístroj jeho absorbanciu od nameranej hodnoty vzorky automaticky odpočíta
- riedenie vzorky – vzorka sa nariedi vodou tak, aby sa koncentrácia rušivej chemikálie dostala pod jej limit interferencie, zatiaľ čo proteín zostane stále v merateľnom rozsahu
- precipitácia (vyzrážanie) proteínov – proteíny sa zo vzorky selektívne vyzrážajú pridaním kyseliny trichlóroctovej (TCA). Po centrifugácii sa tekutý roztok s nečistotami odstráni a proteínový sediment sa rozpustí v čistom roztoku, kde sa následne zmeria.
Kalibrácia a matematické spracovanie dát link
Kým pri rutinnom stanovení biuretovou metódou nám vďaka vysokej linearite niekedy postačuje porovnanie s jedným štandardom, pri citlivejších spektrofotometrických metódach (ako BCA, Bradford či Lowry) nedokážeme presnú koncentráciu proteínu spoľahlivo určiť z jedného bodu. Každé takéto meranie vyžaduje realizáciu viacbodového kalibračného postupu.
Kalibráciu a matematické spracovanie dát môžeme rozdeliť na 3 fázy:
- príprava kalibračných štandardov – odmeranie série vzoriek s presne známou koncentráciou referenčného proteínu (napr. BSA)
- zostavenie kalibračnej krivky – zostrojenie grafu závislosti nameranej absorbancie od koncentrácie štandardu
- výpočet koncentrácie – matematický výpočet skutočnej koncentrácie v pôvodnej vzorke s ohľadom na prípadné riedenie proteínu (riediaci faktor), ak sme ho aplikovali
Príprava kalibračných štandardov link
V každom experimente musíme súbežne s našimi neznámymi vzorkami odmerať sériu vzoriek s presne známou koncentráciou referenčného proteínu. Ako tento štandard sa celosvetovo najčastejšie používa hoväzdí sérový albumín (BSA, angl. Bovine Serum Albumin).
Pripraví sa séria skúmaviek (napríklad 7 až 8) so stúpajúcou koncentráciou BSA v rozmedzí od 0 (tzv. slepá vzorka – angl. blank, obsahujúci iba vodu a rovnaký pufor ako vzorky) až po limitný rozsah metódy (napr. 2,0 mg/ml pri BCA).
BSA štandardy: [Blank (0,0 mg/ml)] → [0,25 mg/ml] → [0,50 mg/ml] → [1,00 mg/ml] → [2,00 mg/ml]
Zostavenie kalibračnej krivky link
Po pridaní činidla a uplynutí inkubačnej doby odmeriame absorbanciu pre všetky štandardy aj naše neznáme vzorky. Z nameraných hodnôt štandardov spektrofotometer (alebo počítačový program) zostrojí kalibračnú krivku (graf, kde na osi x je nanesená známa koncentrácia štandardu a na osi y nameraná absorbancia).
V ideálnom prípade má táto závislosť lineárny charakter a riadi sa rovnicou priamky (regresnou rovnicou):
Absorbancia (A) = Smernica (Slope) × Koncentrácia (c) + Úsek (Intercept)
Výpočet neznámej koncentrácie a riediaci faktor link
Z tejto rovnice vieme pre každú našu neznámu vzorku s nameranou absorbanciou matematicky spätne vypočítať jej koncentráciu \( (c) \):
\( c = (A_{\text{vzorka}} - \text{Úsek}) / \text{Smernica} \)
- Uplatnenie riediaceho faktora – ak bola naša pôvodná biologická vzorka (napr. hustý bunkový lyzát) príliš koncentrovaná a museli sme ju pred analýzou nariediť (napríklad 1 diel vzorky a 3 diely vody, čo je riedenie 1:4), vypočítanú koncentráciu \( c \) musíme vynásobiť prevrátenou hodnotou riedenia (v tomto prípade číslom 4), aby sme dostali skutočnú koncentráciu v pôvodnej vzorke.
Modelový príklad: Stanovenie koncentrácie proteínu (BCA metóda) link
Predstav si, že máš v laboratóriu neznámu vzorku proteínu (napr. bunkový lyzát). Chceš zistiť jej skutočnú koncentráciu, aby si ju mohol naniesť na gél.
Krok 1: Príprava kalibrácie (BSA štandardy) link
Do štyroch skúmaviek si pripravíš sériu známych koncentrácií hovädzieho sérového albumínu (BSA). Do piatej dáš len čistú vodu/pufor (slepá vzorka – blank). Do všetkých pridáš detekčné činidlo, necháš zreagovať a odmeriaš absorbanciu pri 562 nm.
Vo výsledku dostaneš tieto hodnoty (stĺpec nameraná absorbancia):
| Skúmavka | Koncentrácia BSA | Nameraná absorbancia | Absorbancia po odpočítaní blanku |
|---|---|---|---|
| Blank | 0,0 mg/ml | 0,080 | 0,000 |
| Štandard 1 | 0,25 mg/ml | 0,230 | 0,150 |
| Štandard 2 | 0,50 mg/ml | 0,380 | 0,300 |
| Štandard 3 | 1,00 mg/ml | 0,680 | 0,600 |
| Štandard 4 | 2,00 mg/ml | 1,280 | 1,200 |
Krok 2: Zostavenie rovnice priamky link
Z týchto vyčistených hodnôt \( (A) \) vytvoríš graf, kde na osi x je koncentrácia a na osi y je absorbancia. Cez body sa preloží priamka a k nej patrí regresná rovnica.
Smernica priamky je zmena na osi y delená zmenou na osi x – teda o koľko stúpne absorbancia, keď koncentrácia stúpne o 1 mg/ml. Keďže sme odpočítali blank, priamka začína v nule a stačí ti na výpočet jediný štandard:
\( k = \dfrac{0{,}150}{0{,}25} = 0{,}6 \)
Skús to s ktorýmkoľvek ďalším štandardom a vyjde ti to isté, lebo body ležia presne na priamke. V reálnom meraní to tak nikdy nie je – pipetovanie, teplota aj prístroj vnesú malé odchýlky, takže z jedného štandardu by ti vyšlo trochu iné číslo ako z druhého. Preto sa v praxi smernica nepočíta ručne: softvér preloží priamku cez všetky body naraz (metódou najmenších kvadrátov) a vypíše ti už hotovú rovnicu:
\( A = 0{,}6 \times c + 0 \)
- Smernica (Slope) = 0,6 (vyjadruje, ako strmo krivka stúpa)
- Úsek (Intercept) = 0 (keďže sme odpočítali blank, priamka začína presne v nule)
- Koeficient determinácie R² = 1,000 (body ležia na priamke, kalibrácii sa dá veriť)
Krok 3: Meranie neznámej vzorky a riedenie link
Máš neznámu vzorku, o ktorej tušíš, že je veľmi koncentrovaná. Aby si neprekročil rozsah metódy (ktorá meria maximálne do 2,0 mg/ml), nariediš ju 1:5 (čiže 1 diel vzorky + 4 diely vody).
Túto nariadenú vzorku zmeriaš rovnakým spôsobom:
- Nameraná absorbancia nariedenej vzorky: 0,530
- Po odpočítaní blanku (0,080) dostaneš čistú absorbanciu vzorky: \( A_{vzorka} = 0{,}450 \)
Krok 4: Výpočet krok za krokom link
Výpočet koncentrácie v meranej (nariadenej) skúmavke:
Použiješ našu rovnicu priamky, z ktorej vyjadríš koncentráciu \( (c) \):
\( c = \frac{A_{vzorka}}{\text{Smernica}} = \frac{0{,}450}{0{,}6} = \mathbf{0{,}75\text{ mg/ml}} \)
V skúmavke, ktorú si reálne strčil do spektrofotometra, je koncentrácia proteínu 0,75 mg/ml.
Prepočet na pôvodnú (neriedenú) vzorku:
Keďže si vzorku pred meraním nariedil 1:5, skutočná koncentrácia v tvojej pôvodnej banke je 5-krát vyššia. Vypočítanú hodnotu preto vynásobíš riediacim faktorom (5):
\( \text{Skutočná koncentrácia} = 0{,}75\text{ mg/ml} \times 5 = \mathbf{3{,}75\text{ mg/ml}} \)
Výsledok:
Tvoja neznáma vzorka má koncentráciu 3,75 mg/ml.
Odkazy na literatúru
- Civínová, K: Stanovení bílkovin. (2023). Univerzita Karlova. Bakalářská práce.
- Kopecká, D: Molecular approaches in the analysis of chronic pain in mice. (2008). Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra biochemických věd. Diplomová práce.
- Masarykova univerzita: Úloha č. 2: Stanovení koncentrace proteinů pomocí BCA metody. (2014). Masarykova univerzita.
