Molekulárna regulácia životného cyklu bakteriofága λ

AUTOR: Andrej Soós

 

Bakteriofág lambda je krásnym príkladom „molekulárnych prepínačov“. Na základe pochopenia molekulárnej regulácie jeho životného cyklu bolo možné pochopiť, ako fungujú rôzne komplexné regulačné mechanizmy aj v eukaryotických bunkách. Jeho genóm tvorí lineárna dsDNA a veľkosť genómu činí 48 502 bp a patrí medzi mierne (temperované) fágy – tie, ktoré sú schopné aj lyzogénneho cyklu. Napadá baktériu Escherichia coli.

V kapitole o vektoroch bol popísaný lytický aj lyzogénny cyklus. Preto ich len v krátkosti zhrniem:

Lytický cyklus

Pri lytickom cykle fág po infekcii bunky cirkularizuje svoju DNA cez cos-miesta, čo sú komplementárne konce umožňujúce cirkularizáciu. Po cirkularizácii sa fág najprv replikuje tzv. théta-mechanizmom (θ-replikácia, čo je odvodené od tvaru molekuly DNA, ktorá je analogická s replikáciou genómu E. coli a pripomína grécke písmeno θ) a neskôr mechanizmom otáčajúcej sa kružnice. Týmto mechanizmom sa tvoria dlhé zreťazené genómy fága λ, ktoré sa potom naštiepia na jednotlivé lineárne DNA a zabaľujú sa do novovytvorených kapsidov. Nasleduje lýza bunky a uvoľnenie fágových častíc, ktoré môžu napadať ďalšie baktérie.

**pozn.: Lýza bunky neprebieha spôsobom, že by sa nasyntetizovalo toľko fágov, až bunka praskne; fág totiž produkuje bielkoviny, ktoré sú schopné baktériu zlyzovať.**

Lyzogénny cyklus

Pri lyzogénnom cykle sa bakteriofág pomocou integrázy (Int) a ďalších hostiteľských bielkovín integruje do bakteriálneho chromozómu. Replikuje sa tak aj s baktériou, neubližuje jej. Ide tak o „spiaceho fága“, ktorý nelyzuje bunku, ale napr. v prípade pôsobenia UV-žiarenia je schopný sa z baktérie vystrihnúť pomocou excizionázy (Xis) a hostiteľských bielkovín a spustiť lytický cyklus.

Integrácia fága λ je typickým príkladom tzv. miestne-špecifickej rekombinácie (angl. site-specific recombination) – integruje sa na konkrétnom mieste bakteriálneho chromozómu. Toto miesto sa nazýva attB (attachment bacteria). Aj fág λ má vo svojom genóme takúto sekvenciu, ktorá je veľmi podobná attB a nazýva sa attP (attachment phage). Integrázou sa vytvoria lepivé konce, sekvencie attB a attP sa spárujú a nastáva ligácia (pozn.: aj ligáciu katalyzuje integráza). Sekvencia attB leží medzi operónmi gal a bio.

Ako to je teda s rozhodovaním sa o konkrétnom cykle? V prípade fága lambda ide o dva kľúčové gény: Cro a cI (čítaj „cé jedna“). Gén cro kóduje represor génov potrebných pre lyzogénny cyklus. Gén cI kóduje represor lytických génov. Lyzogénn gény označíme ako „ľavé gény“, lytické ako „pravé gény“.

Po infekcii sa spustí transkripcia oboch génov, cI i cro. Presnejšie povedané, gén cI je spustený nepriamo cez gén N, ktorý potom umožní jeho transkripciu. Gén N má vlastný terminátor, avšak po vytvorení proteínu N je možné transkribovať gén cI. Ako je to možné, keď je za génom N terminátor? Fág λ je príkladom využitia mechanizmu antiterminácie, ktorý umožňuje „ignorovať“ terminátor. RNA polymeráza teda prejde cez terminátor vďaka proteínu N (a ďalších hostiteľských proteínov) a dostane sa teda až ku génu cI.

Po transkripcii a translácii dvoch kľúčových génov (cI a cro) závisí, ktorého proteínu je viac. Ak vyhráva proteín CI, reprimuje lytické gény a fág transkribuje lyzogénne gény (napr. integrázu). Naopak, ak je viac proteínu Cro, fág reprimuje lyzogénne gény a exprimuje lytické gény (gény hlavičky, bičíka, replikačné proteíny...). Tým sa rozhodne o lytickom alebo lyzogénnom cykle.

Ak je fág v lyzogénnom cykle integrovaný ako profág („spiaci fág“), stále exprimuje gén cI a vytvára teda proteín CI (nazývaný aj λ-represor). Tým sa dostávam k tzv. fágovej imunite. To znamená, že ak ďalší fág λ napadne baktériu, CI proteín hneď zabraňuje expresii lytických génov. Za istých podmienok, ako je napr. pôsobenie UV-žiarenia, baktérii (a tým pádom aj profágovi) môže hroziť výrazné poškodenie DNA. Preto baktéria aktivuje tzv. SOS-odpoveď. Jeden z proteínov, ktoré s ňou súvisia, je proteín RecA. Tento proteín má u baktérie E. coli funkcie napríklad pri rekombinácii, ale aj pri SOS-odpovedi. Je schopný navodiť rozštiepenie cI proteínu a tým pádom „rozbiť múr brániaci transkripcii lytických génov“. Ak sa tak stane, okamžite sa aktivujú lytické gény cez Cro proteín, replikačné gény, gény pre excizionázu a ďalšie fágové komponenty (hlavička, bičík). Týmto dôjde k vystrihnutiu – excízii – profága, replikácii λ-DNA a tvorbe nových vírusových častíc – dôjde k „prechodu“ do lytického cyklu. Prechod z lyzogénneho do lytického cyklu sa nazýva indukcia.