Bielkoviny

Bielkoviny – proteíny – sú po chemickej stránke lineárne biopolyméry zložené z aminokyselín, navzájom pospájaných kovalentnou peptidovou väzbou, preto sa zvyknú nazývať aj polypeptidy. Polypeptidový reťazec môže sám o sebe tvoriť jednu funkčnú molekulu proteínu, ale proteín môže byť zložený aj z viacerých polypeptidových reťazcov, čo úzko súvisí s kvartérnou štruktúrou proteínov.

Proteíny sú makromolekulové látky s absolútne osobitným postavením v živých systémoch. Predstavujú štruktúru, ktorá podmieňuje základné prejavy života organizmov. Možno povedať, že sám „život je vo svojej podstate osobitnou formou existencie bielkovín“ (FRIEDRICH ENGELS). Pri evolúcii živých systémov boli proteíny pralátkou (gr. protos – prvý), na ktorej sa formoval celý ďalší vývoj organizmov. V súčasnosti nepoznáme život bez bielkovín.

Bielkoviny plnia v organizme rozmanité funkcie:

Štruktúra bielkovín link

Bielkoviny môžu svoje funkcie vykonávať len vtedy, keď sú zbalené do patričného tvaru, takzvanej priestorovej konformácie. Správna konformácia bielkoviny zabezpečuje optimálnu špecifickú interakciu s inou molekulou (napríklad vzťah enzým – substrát), sprostredkovanú slabými nekovalentnými väzbami (vodíkové mostíky, van der Waalsove sily, iónové alebo hydrofóbne interakcie) medzi aminokyselinovými postrannými reťazcami (R-skupinami) a danou molekulou rôznej chemickej povahy. Konformácia bielkoviny je priamo daná jej zložením, teda počtom a presným poradím jednotlivých aminokyselín tvoriacich polypeptidový reťazec. Tak ako v prípade nukleových kyselín, aj pri bielkovinách sa stretávame s rôznym stupňom priestorovej organizácie jej stavebných molekúl.

Primárna štruktúra link

Primárna štruktúra je daná presným počtom a poradím aminokyselín v polypeptidovom reťazci. Toto exaktné poradie je bezprostredne zakódované v štruktúrnych génoch v DNA (vo forme kodónov) a prepisuje sa cez mRNA. Z hľadiska biologických vlastností bielkoviny je primárna štruktúra absolútne najdôležitejšia, pretože priamo podmieňuje všetky ostatné typy štruktúr (sekundárnu, terciárnu), a tým aj celkovú biologickú funkciu proteínu. Akákoľvek mutácia v géne môže zmeniť primárnu štruktúru, čo môže viesť k znefunkčneniu bielkoviny (napríklad pri kosáčikovitej anémii).

Bielkoviny sú zložené z aminokyselín, ktoré sú pospájané do rôzne dlhých reťazcov pevnou kovalentnou peptidovou väzbou (−CO−NH−). Táto väzba vzniká dehydratačnou (kondenzačnou) reakciou medzi karboxylovou skupinou (−COOH) jednej aminokyseliny a aminoskupinou (−NH₂) nasledujúcej aminokyseliny, pričom sa odštepuje molekula vody. Peptidová väzba má jednu veľmi dôležitú vlastnosť – má pevnú, rovinnú (planárnu) štruktúru. V dôsledku delokalizácie π-elektrónov (mezomérny efekt) má čiastočne charakter dvojitej väzby, čo znamená, že okolo nej nie je možná voľná rotácia. Polypeptidový reťazec sa môže priestorovo ohýbať len v miestach takzvaných α-uhlíkov (uhlíkov, ktoré nesú bočné R-skupiny) a táto vlastnosť priamo obmedzuje to, do akých tvarov sa môže bielkovina zbaliť.

Vďaka spôsobu, akým sa aminokyseliny spájajú, má každý polypeptidový reťazec svoju prísnu polaritu (smerovosť):

• na jednom konci reťazca sa nachádza voľná aminoskupina – ide o takzvaný N-koniec (N-terminus)
• na opačnom konci sa nachádza voľná karboxylová skupina – ide o takzvaný C-koniec (C-terminus)

Podľa počtu pospájaných aminokyselín rozoznávame oligopeptidy (do 10 aminokyselín), polypeptidy (11 až 100 aminokyselín) a veľké proteíny (viac ako 100 aminokyselín). V štruktúre bielkovín živých organizmov sa stabilne vyskytuje 20 základných (štandardných) proteínogénnych aminokyselín, ku ktorým sa v špecifických prípadoch počas translácie môžu pridať aj vzácnejšie aminokyseliny selenocysteín (21.) a pyrolizín (22.).

Sekundárna štruktúra link

Sekundárna štruktúra už naznačuje isté lokálne geometrické usporiadanie – konformáciu bielkoviny. Je podmienená predovšetkým vodíkovými mostíkmi medzi karbonylovými skupinami (−C=O) a aminoskupinami (H−N−) nachádzajúcimi sa v kostre polypeptidového reťazca (nezúčastňujú sa na nich variabilné R-skupiny). Rozoznávame dva základné typy sekundárnej konformácie (motívy):

• skladaný list (β-štruktúra)
• skrutkovica (α-helix)

Medzi týmito motívmi netvorí polypeptidový reťazec nijaký špeciálny, definovaný tvar, naopak, skladaný list a skrutkovica sú definované pomerne presne. Sekundárna štruktúra neznámeho proteínu sa napriek tomu, že je daná už jeho primárnou štruktúrou, pomerne ťažko predikuje (predpokladá). Prakticky sa vychádza len z experimentálnych priestorových meraní pre iné proteíny a výpočtu pravdepodobnosti, s akou sa dané susediace aminokyseliny zvyknú nachádzať v tom-ktorom motíve.

Skladaný list link

Skladaný list (β-štruktúra) môže mať usporiadanie paralelné alebo antiparalelné. Tvoria ho reťazce (alebo úseky jedného reťazca) radené vedľa seba, ktoré sú priečne spojené vodíkovými mostíkmi medzi karbonylovými a aminoskupinami. Aminokyselinové zvyšky (−R) sú orientované striedavo nad a pod rovinu skladaného listu, aby si priestorovo nezavadzali. Takúto štruktúru má napríklad fibroín, bielkovina tvoriaca prírodný hodváb.

Skrutkovica link

Skrutkovica (α-helix) vzniká v rámci jedného reťazca. Stabilitu skrutkovice podmieňujú vodíkové mostíky nad sebou ležiacich závitov (vznikajú vždy medzi 1. a 5. aminokyselinou v poradí). Vďaka tomu, že všetky biologické aminokyseliny majú L-konfiguráciu, je α-helix v prírode takmer výlučne pravotočivý. Bočné reťazce aminokyselín pritom smerujú von zo skrutkovice a na jeden celý závit pripadá priemerne 3,6 zvyšku aminokyseliny. Takúto priestorovú stavbu má väčšina globulárnych bielkovín, ale aj známa vláknitá štruktúrna bielkovina α-keratín vo vlasoch a nechtoch.

Kolagénová štruktúra link

Okrem dvoch základných motívov existuje aj špecifická takzvaná kolagénová štruktúra (kolagénový helix), ktorá je typická pre kolagén (hlavnú bielkovinu spojivových tkanív, šliach a kostí). Je tvorená tromi špeciálne zvinutými polypeptidovými reťazcami, ktoré sú navzájom stočené do podoby pevného lana, čo dodáva týmto tkanivám obrovskú mechanickú pevnosť v ťahu.

Terciárna štruktúra link

Terciárna štruktúra (konformácia) predstavuje definitívne trojrozmerné priestorové usporiadanie skrutkovíc a skladaných listov poprepájaných rôzne zvlneným voľným polypeptidovým vláknom. Proteíny pritom môžu obsahovať (a často aj obsahujú) úseky skrutkovice aj úseky usporiadané ako skladaný list, a celá priestorová štruktúra bielkoviny môže byť preto veľmi komplikovaná.

Táto štruktúra je stabilizovaná vzájomnými interakciami funkčných R-skupín jednotlivých aminokyselín. Patrí sem množstvo nekovalentných väzieb (vodíkové väzby, van der Waalsove sily, iónové interakcie, hydrofóbne interakcie), ako aj silné kovalentné väzby, najmä disulfidické mostíky (−S−S−), ktoré vznikajú špecificky prepojením dvoch sírnych aminokyselín – cysteínov. Pri správnej konformácii bielkoviny majú obrovský význam aj hydrofóbne interakcie, pri ktorých sa nepolárne R-skupiny zhlukujú do stredu molekuly, aby sa vyhli vode, v ktorej sa bielkovina nachádza. Pomerne osobitnú skupinu bielkovín tvoria membránové proteíny, ktoré obsahujú predikovateľné (predpovedateľné) motívy prechádzajúce fosfolipidovou dvojvrstvou biomembrán. Tieto funkčné membránové proteíny tvoria napríklad špecifické iónové kanály, zložité transportné systémy, lokálne pôsobiace enzýmy a receptory zachytávajúce signály.

Terciárna štruktúra dáva molekule definitívny priestorový tvar. Na základe neho sa bielkoviny zvyčajne formujú buď do podoby dlhých vláken (fibrilárne proteíny), alebo do tvaru kompaktného klbka (globulárne proteíny).

Pre biologickú funkciu bielkoviny má práve terciárna štruktúra podstatný význam. Napríklad za biologickú aktivitu enzýmov alebo protilátok sú zodpovedné miesta na povrchu ich molekúl – aktívne centrá, ktorých presnú stavbu určuje práve terciárna štruktúra. Ak sa táto štruktúra poruší napríklad vplyvom vysokej teploty alebo zmeny pH (dochádza k denaturácii), rozmotá sa a daná bielkovina navždy stráca svoju biologickú funkciu.

Kvartérna štruktúra link

Kvartérnu štruktúru majú iba niektoré veľmi zložité bielkoviny, ktoré sú zložené z viacerých samostatných bielkovinových podjednotiek – polypeptidových reťazcov. Kvartérna štruktúra predstavuje definitívne usporiadanie a pospájanie takýchto podjednotiek v priestore do jednej obrovskej funkčnej makromolekuly. Dôležité je, že jednotlivé podjednotky už nie sú navzájom spojené pevnými peptidovými väzbami (tie sú len v rámci samotných reťazcov). Toto spojenie polypeptidových reťazcov je takisto dané predovšetkým slabými medzimolekulovými interakciami (alebo disulfidickými mostíkmi). Vďaka tomu sa môžu podjednotky v bunke často relatívne ľahko odpájať a znova spájať. Typickým stredoškolským príkladom bielkoviny s kvartérnou štruktúrou je hemoglobín (skladá sa zo 4 podjednotiek).

Vlastnosti a rozdelenie bielkovín link

Vlastnosti bielkovín sú podmienené ich chemickým zložením, štruktúrou a molekulovou hmotnosťou. Sú to tuhé látky, ich rozpustnosť vo vode je veľmi odlišná a vo vodných roztokoch tvoria koloidné sústavy. Vzhľadom na prítomnosť rôznych aminokyselín nesú makromolekuly bielkovín elektrický náboj, ktorého veľkosť závisí od pH prostredia. Pri určitej hodnote pH, ktorá sa nazýva izoelektrický bod, je molekula navonok elektricky neutrálna a je vo vode najmenej rozpustná. Tento jav sa v biológii a medicíne využíva na oddeľovanie zmesí bielkovín pomocou jednosmerného elektrického prúdu, čo nazývame elektroforéza.

Pridaním roztokov ľahkých solí (napríklad síranu amónneho) možno bielkoviny z koloidného roztoku dočasne vyzrážať vo forme vločiek (takzvané vysolovanie). Tento dej je vratný (koagulácia) a po odstránení soli (napríklad pridaním čistej vody) bielkovina opäť prejde do roztoku a zachováva si svoje pôvodné vlastnosti aj biologickú aktivitu.

Podľa tvaru molekuly delíme bielkoviny na:

• fibrilárne (vláknité) bielkoviny – sú väčšinou tenké a dlhé, nerozpustné vo vode a majú veľkú molekulovú hmotnosť. Plnia najmä štruktúrnu a mechanickú funkciu (napríklad kolagén vo väzive, keratín vo vlasoch, myozín vo svaloch alebo fibroín v pavučinách).
• globulárne (klbkovité) bielkoviny – sú zvinuté do kompaktného trojrozmerného tvaru a dobre rozpustné vo vode. Plnia aktívne a dynamické funkcie (napríklad všetky enzýmy, protilátky – imunoglobulíny, krvné albumíny alebo históny, ktoré sa v bunkovom jadre viažu na DNA).

Podľa rozpustnosti rozoznávame:

• albumíny – sú dobre rozpustné už aj v čistej (destilovanej) vode
• globulíny – v čistej vode sú nerozpustné, sú však rozpustné v zriedených roztokoch solí (vďaka čomu môžu byť bez problémov voľne rozpustené v krvnej plazme)

Podľa prítomnosti nebielkovinovej zložky sa delia na:

• jednoduché (proteíny) – sú zložené výlučne len z aminokyselinových zvyškov
• zložené (proteidy) – okrem aminokyselín obsahujú aj nebielkovinovú zložku (takzvanú prostetickú skupinu). Patria sem napríklad:
  • nukleoproteidy – obsahujú zložku nukleovej kyseliny (napríklad ribozomálne podjednotky, telomeráza, ale z chemického hľadiska sú nukleoproteínmi aj samotné vírusy)
  • glykoproteidy – majú v molekule naviazaný polysacharidový reťazec (napríklad hlien mucín v slinách, aglutinogény určujúce krvné skupiny na membránach erytrocytov alebo infekčné prióny)
  • fosfoproteidy – v molekule majú estericky viazanú fosforečnú skupinu H₃PO₄ (napríklad mliečna zásobná bielkovina kazeín)
  • lipoproteidy – nebielkovinovou zložkou sú lipidy (napríklad transportné častice v krvi LDL, HDL)
  • metaloproteidy – obsahujú v molekule priamo viazaný ión kovu (napríklad zásobná bielkovina feritín obsahuje železo)
  • chromoproteidy – obsahujú naviazanú zväčša väčšiu farebnú prostetickú skupinu, ktorá spôsobuje výrazné sfarbenie molekuly (napríklad hemoglobín a myoglobín obsahujú červený hem, cytochrómy)

Všetky modifikácie bielkovín, zahŕňajúce väzbu alebo asociáciu s nebielkovinovými zložkami, sú vykonávané posttranslačne, väčšinou pomocou rôznych špecifických enzýmov.

Denaturácia bielkovín link

Bielkoviny, ktoré sú zvinuté do svojej správnej priestorovej konformácie a sú schopné v organizme vykonávať svoje biologické funkcie, sa nazývajú natívne bielkoviny.

Denaturácia bielkovín je zmena priestorového usporiadania polypeptidového reťazca vplyvom nepriaznivých vonkajších faktorov (napríklad vysokým teplom, ionizujúcim žiarením, ťažkými kovmi, silnými kyselinami a zásadami, alebo aj silným mechanickým trepaním). Ide o porušenie a rozmotanie vyšších štruktúr bielkoviny (sekundárnej, terciárnej, kvartérnej), pričom zostane zachovaná len jej primárna štruktúra (peptidové väzby sa pri denaturácii neštiepia!). Pri denaturácii zákonite dochádza k strate špecifického tvaru a k zániku biologickej funkcie bielkoviny. Veľmi často je tento proces sprevádzaný stratou rozpustnosti a viditeľným vyzrážaním (koaguláciou) bielkoviny z roztoku.

Denaturácia bielkoviny môže byť:

• vratná (reverzibilná) – ak sa priestorová štruktúra bielkoviny po odstránení denaturačného faktoru opäť spontánne obnoví (proces sa nazýva renaturácia bielkoviny)
• nevratná (ireverzibilná) – ak sa štruktúra bielkoviny už obnoviť nemôže (napríklad uvarenie vaječného bielka z pôvodne číreho roztoku na bielu tuhú hmotu, alebo vyšľahanie bielkového snehu)

Obrovský praktický význam má denaturácia v potravinárskom priemysle a v domácnosti pri uchovávaní a tepelnom spracovaní potravín. Varením alebo inou tepelnou úpravou sa bielkoviny denaturujú, porušia sa zložité väzby vo vyšších štruktúrach a bielkovina sa stane oveľa stráviteľnejšou. Svoju biologickú (výživovú) hodnotu si pritom zachováva, pretože denaturované bielkoviny majú neporušené aminokyseliny tvoriace primárnu štruktúru. Organizmus tak môže rozvinuté bielkoviny v tráviacej sústave oveľa ľahšie enzymaticky rozložiť a uvoľnené aminokyseliny využiť pre svoje potreby. Okrem toho má denaturácia obrovský hygienický význam – ničí totiž bielkoviny v choroboplodných zárodkoch (baktériách a vírusoch), a tak slúži ako tepelná a chemická sterilizácia.

Dôkazy bielkovín a aminokyselín (Farebné reakcie) link

Biuretova reakcia link

Slúži na dôkaz prítomnosti peptidových väzieb (−CO−NH−). Činidlom je 10 % hydroxid sodný (NaOH) a 0,1 % síran meďnatý (CuSO₄). Bielkoviny dávajú v alkalickom prostredí s iónmi Cu²⁺ charakteristický farebný komplex. Intenzita zafarbenia závisí od molekulovej hmotnosti bielkoviny (polypeptidy farbia roztok na fialovo, menšie peptidy skôr na červeno).

Ninhydrínová reakcia link

Pozitívnu ninhydrínovú reakciu (0,1 % ninhydrín) dávajú voľné aminokyseliny a bielkoviny s voľnou aminoskupinou (−NH₂) a karboxylovou skupinou (−COOH). Reakcia prebieha pri zahriatí v niekoľkých stupňoch, pričom jej výsledkom je modré až fialové zafarbenie roztoku.

Xantoproteínová reakcia link

Používa sa na všeobecný dôkaz aromatických aminokyselín (tyrozín, tryptofán, fenylalanín). Po pridaní koncentrovanej kyseliny dusičnej (HNO₃) dochádza k nitrácii aromatického benzénového jadra. Po povarení vzniká biela až žltá zrazenina, ktorá po pridaní 20 % NaOH prejde na výrazne oranžovú.

Špecifické dôkazy jednotlivých aminokyselín link

Adamkiewiczova reakcia špeciálne dokazuje prítomnosť aminokyseliny tryptofán (reaguje jeho indolový kruh), pričom vzniká charakteristický fialový prstenec.

Millonovo činidlo dokazuje hydroxyfenylovú skupinu prítomnú v tyrozíne (roztok Hg v kyseline dusičnej HNO₃), pričom po zahriatí vzniká červenohnedé sfarbenie.

Dôkazy síry link

Prítomnosť síry v molekulách aminokyselín sa dá analyticky dokázať viacerými činidlami. Tiolovú skupinu (−SH) dokazujeme nitroprusidom sodným v amoniakálnom prostredí, čo sa prejaví vznikom červeného zafarbenia roztoku. Ďalšou možnosťou je dôkaz pomocou octanu olovnatého s NaOH. Po pridaní týchto látok a následnom povarení vzniká hnedá až čierna zrazenina sulfidu olovnatého (PbS). Týmto spôsobom dokazujeme predovšetkým síru prítomnú vo forme voľnej −SH skupiny v cysteíne. Naopak, metionín túto reakciu spravidla neposkytuje, keďže má atóm síry pevne viazaný v nereaktívnej tioéterovej väzbe (−S−CH₃).