Western blot (western blotting, imunoblotovanie) patrí k základným a najpoužívanejším pilierom modernej molekulárnej biológie a biochémie. Táto vysoko citlivá analytická metóda umožňuje identifikáciu, charakterizáciu a semikvantitatívne stanovenie špecifických proteínov v komplexných biologických zmesiach (ako sú bunkové lyzáty či tkanivové homogenáty). Metóda elegantne spája tri kľúčové princípy: separáciu podľa veľkosti, prenos na pevnú matricu a špecifickú vizualizáciu pomocou protilátok.
Názov western blot vznikol ako geografická slovná hračka. Keď EDWIN SOUTHERN v roku 1975 vyvinul metódu prenosu DNA na membránu (Southern blot), započal novú éru prenosových techník. Keď neskôr ALWINE a kol. (1977) opísali prenos RNA, metóda dostala názov northern blot. Na zachovanie tejto neformálnej geografickej nomenklatúry bol prenos proteínov, opísaný TOWBINOM a kol. (1979) a upravený BURNETTOM (1981), nazvaný western blot. Okrem toho, v slovenčine sa bežne používa „blot“ aj „blotting“, hoci striktne vzaté, blotting je tá metóda a blot označuje konkrétny jej výsledok (membránu s prúžkami).
Príprava bunkového lyzátu a kvantifikácia proteínov link
Úspech celého experimentu závisí od kvality vstupnej vzorky. Cieľom je rozrušiť bunkové membrány a uvoľniť intaktné proteíny do roztoku, pričom sa musí zabrániť ich nežiaducej degradácii.
Lýza buniek a proteázy link
Lýza sa vykonáva pomocou chemických detergentov v pufri (napr. RIPA pufer), ktorý solubilizuje membrány a proteíny.
- typické zloženie RIPA pufru – 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 % NP-40 (alebo Triton X-100), 1 mM EDTA (pH 8,0) a prípadne deoxycholát sodný
- ochrana pred proteolýzou – počas disrupcie buniek sa uvoľňujú endogénne proteázy, ktoré by mohli cieľový proteín degradovať. Lýzu preto musíme vykonávať striktne na ľade (4 °C) za prítomnosti koktailu inhibítorov proteáz (napr. PMSF na inhibíciu serínových proteáz, aprotinín či AEBSF).
Kvantifikácia proteínov link
Pred nanesením vzorky na gél je kritické poznať presnú koncentráciu celkových proteínov, aby sa zabezpečilo rovnomerné nanášanie (angl. equal loading).
- Bradfordova metóda – je založená na väzbe farbiva Coomassie Brilliant Blue G-250. Je rýchla, avšak vykazuje silnú inkompatibilitu s detergentmi (ako je Triton X-100, NP-40 či SDS), ktoré sú bežnou súčasťou RIPA pufru. Prítomnosť detergentov spôsobuje precipitáciu činidla a skreslenie výsledkov.
- BCA esej (kyselina bicinchoninová) – je preferovanou voľbou pre vzorky lyzované v RIPA pufri. Reakcia prebieha v dvoch krokoch: najprv proteíny v alkalickom prostredí redukujú meďnaté ióny (Cu²⁺) na meďné (Cu⁺) a následne chelatáciou Cu⁺ s BCA vzniká intenzívny fialový komplex absorbujúci svetlo pri 562 nm. Tento systém toleruje prítomnosť detergentov až do koncentrácie 5 %.
Denaturácia proteínov a príprava na SDS-PAGE link
Proteíny sa v natívnom stave nachádzajú v zložitej terciárnej či kvartérnej konformácii. Aby sme ich mohli rozdeliť výhradne podľa ich molekulovej hmotnosti, musíme ich kompletne denaturovať (rozbaliť do lineárnych reťazcov) a udeliť im uniformný náboj.
To sa dosahuje pridaním Laemmliho loading pufru (vzorkového pufru) a následným zahriatím vzorky pri 95–100 °C počas 5 minút.
Kľúčové zložky loading pufru sú:
- SDS (dodecylsulfát sodný) – silný aniónový detergent, ktorý rozrušuje nekovalentné interakcie a denaturuje proteíny. SDS sa viaže na polypeptidový reťazec v konštantnom pomere (približne 1,4 g SDS na 1 g proteínu), čím maskuje prirodzený náboj proteínu a udeľuje mu uniformný záporný náboj. Proteíny tak v elektrickom poli migrujú výhradne na základe svojej veľkosti smerom k anóde (+).
- β-merkaptoetanol (alebo DTT) – redukčné činidlo, ktoré štiepi kovalentné disulfidické mostíky (S-S väzby medzi cysteínmi), čím prispieva k úplnému rozvinutiu proteínovej štruktúry
- glycerol – zvyšuje hustotu a viskozitu vzorky, vďaka čomu vzorka po nanesení klesne priamo na dno jamky gélu a nezmieša sa s behovým pufrom
- bromfenolová modrá – malé aniónové farbivo s vysokou pohyblivosťou. Slúži ako čelo elektroforézy (migruje najrýchlejšie), čo laborantovi umožňuje vizuálne sledovať priebeh separácie a včas vypnúť zdroj napätia.
Diskontinuálna gélová elektroforéza link
Separácia proteínov prebieha v polyakrylamidovom géli, ktorý funguje ako molekulové sito. Western blot štandardne využíva diskontinuálny gélový systém, ktorý pozostáva z dvoch odlišných fáz:
| Parameter | Stacking gél (zaostrovací) | Separating/Resolving gél (deliaci) |
|---|---|---|
| Umiestnenie | horná časť gélu, obsahuje jamky | dolná, hlavná časť gélu |
| pH prostredia | mierne kyslé (pH 6,8) | zásadité (pH 8,8) |
| Koncentrácia akrylamidu | nízka (približne 4 %) | vyššia (6–15 % v závislosti od cieľa) |
| Funkcia | zaostrenie proteínov do tenkého štartovacieho pásu | samotná separácia podľa molekulovej hmotnosti |
Výber koncentrácie akrylamidu link
Póry v deliacom géli sú definované koncentráciou akrylamidu. Čím menší proteín hľadáme, tým vyššie percento akrylamidu (menšie póry) potrebujeme, aby sme dosiahli dostatočné rozlíšenie:
- mTOR (veľký proteín, približne 250 kDa) – vyžaduje nízkopercentný gél (6–8 %), ktorý má veľké póry a umožní takto veľkým makromolekulám vôbec migrovať
- Rac1 (malý proteín, približne 22 kDa) – vyžaduje vysokopercentný gél (10–12 %), v ktorom sa malé proteíny nezmnožia a nezmiznú v behu
Elektrotransfer proteínov na membránu link
Po ukončení SDS-PAGE sú proteíny úspešne rozdelené v géli, no gél sám o sebe je krehký a protilátky doň nedokážu efektívne penetrovať. Proteíny preto musíme preniesť (nablotovať) na pevnú, adherentnú membránu.
Prenos prebieha pôsobením elektrického prúdu orientovaného kolmo na plochu gélu. Keďže proteíny nesú záporný náboj (vďaka SDS), migrujú smerom ku kladnej elektróde (anóde, červenej).
Skladanie transferového sendviča link
Pri zostavovaní kazety pre mokrý transfer (angl. wet transfer) je kritické zachovať presné poradie vrstiev smerom od katódy (-) k anóde (+):
katóda (-) → špongia → filtračný papier → gél → membrána → filtračný papier → špongia → anóda (+)
Voľba membrány link
Metóda využíva dva základné materiály pevných nosičov:
- nitrocelulózová membrána (NC) – tradičná voľba, má vysokú afinitu k proteínom a nízke nešpecifické pozadie. Je však veľmi krehká (za sucha praská), čo sťažuje opakovanie detekcie (angl. reprobing po odmytí protilátok stripping pufrom).
- PVDF membrána (polyvinylidéndifluorid) – vykazuje vynikajúcu mechanickú pevnosť a je ideálna na stripping a reprobing. Je silne hydrofóbna, preto sa pred samotným transferom musí aktivovať krátkym ponorením do 100 % metanolu, inak by sa transferový pufor na báze vody nedostal do jej pórov.
Blokovanie membrány a imunodetekcia link
Membrána má obrovskú afinitu k akýmkoľvek proteínom. Ak by sme na ňu aplikovali detekčné protilátky priamo, naviazali by sa na voľné miesta na membráne, čo by vyústilo do masívneho tmavého pozadia. Tomu bráni blokovanie voľných miest pomocou nadbytku neutrálneho proteínu.
Výber blokovacieho činidla:
- mlieko (5 % odtučnené sušené mlieko v TBST) – lacné, vysoko efektívne a bežne používané činidlo
- BSA (5 % hovädzí sérový albumín v TBST) – používa sa predovšetkým na detekciu fosforylovaných proteínov (ako je napr. p-mTOR)
Schéma imunodetekčnej kaskády link
Western blot využíva princíp nepriamej detekcie na zvýšenie citlivosti (amplifikáciu signálu).
Kaskáda prebieha v nasledujúcom poradí (od povrchu membrány nahor): na PVDF alebo NC membráne je po transfere imobilizovaný cieľový proteín. Na jeho epitop sa špecificky viaže primárna protilátka. Na ňu sa následne viaže sekundárna protilátka (špecifická proti Fc fragmentu primárnej protilátky), ktorá je konjugovaná s enzýmom HRP alebo AP. Tento enzým nakoniec indukuje svetelný signál pomocou chemiluminiscencie (ECL).
- primárna protilátka – špecificky rozpoznáva a viaže sa na epitop imobilizovaného proteínu. Inkubuje sa zvyčajne cez noc (angl. overnight) pri 4 °C s jemným trasením.
- premývanie (3x v TBST) – odstráni nešpecificky a slabo naviazané primárne protilátky
- sekundárna protilátka – rozpoznáva konštantnú časť (Fc fragment) primárnej protilátky (napr. ak je primárna protilátka králičia, použijeme sekundárnu protilátku koziu anti-králičiu). Je kovalentne spojená s detekčným enzýmom – najčastejšie HRP (chrenová peroxidáza) alebo AP (alkalická fosfatáza). Inkubuje sa 1 hodinu pri izbovej teplote.
- vizualizácia (ECL) – po ďalšom premývaní sa na membránu nanesie substrát pre chemiluminiscenciu (ECL roztok obsahujúci luminol a peroxid vodíka). HRP oxiduje luminol, pričom dochádza k emisii modrého svetla pri vlnovej dĺžke 425 nm. Tento svetelný signál sa zachytí na RTG film v tmavej komore alebo pomocou digitálnej CCD kamery.
Kvantifikácia a loading control link
Výstupný prúžok na filme indikuje prítomnosť proteínu, pričom jeho intenzita (hrúbka) je úmerná množstvu proteínu vo vzorke. Western blot je však považovaný za semikvantitatívnu metódu, pretože účinnosť transferu, nanášania a vývoja filmu sa môže medzi jednotlivými dráhami a experimentmi mierne líšiť.
Na presné vyhodnotenie musíme intenzitu cieľového proteínu normalizovať na tzv. loading control – proteín, ktorého expresia je v bunkách stabilná a nemení sa vplyvom experimentálneho zásahu. Medzi najpoužívanejšie patria:
- β-aktín alebo tubulín (štruktúrne proteíny cytoskeletu)
- GAPDH (metabolický enzým glykolýzy)
Optimalizácia a riešenie problémov link
Hoci je western blot rutinnou metódou, ide o viacstupňový proces, v ktorom sa môže vyskytnúť viacero chýb. Prehľad najčastejších problémov a ich riešení prináša tento zoznam:
| Problém | Možná príčina | Odporúčané riešenie |
|---|---|---|
| Žiadny signál (žiadne prúžky) |
|
|
| Extrémne vysoké pozadie (čierny blot) |
|
|
| Biele škvrny alebo bubliny v prúžkoch |
|
|
| Rozmazané alebo deformované prúžky |
|
|
Odkazy na literatúru
- Towbin, H: Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheet: procedure and some application. (1979). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 118. 177–182.
- Burnette, W. N: “Western blotting”: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. (1981). Analytical biochemistry. 112(2). 195–203. Elsevier. DOI: 10.1016/0003-2697(81)90281-5.
- Kurien, B. T.; Scofield, R. H: Western blotting: Methods and protocols. (2015). 1312. Springer.
- Mahmood, T.; Yang, P.-C: Western blot: technique, theory, and trouble shooting. (2012). North American journal of medical sciences. 4(9). 429. DOI: 10.4103/1947-2714.100998.
