Chí-kvadrát test

Informácie získané z genetického kríženia sú kvantitatívneho charakteru. V genetických experimentoch, ktorých výsledkom býva zistenie početnosti rôznych tried, resp. frekvencia štiepnych pomerov, treba rozhodnúť, či zistené frekvencie zodpovedajú teoreticky očakávaným frekvenciám. \( \chi^2 \)–test nám pomáha pomocou testovateľnej hypotézy porozumieť odchýlkam, ktoré v experimente vznikli.

Vzorec na výpočet \( \chi^2 \) hodnoty:

\( \chi^2 = \sum\limits_{i=1}^n \frac{(e - t)^2}{t} \)

n = celkový počet fenotypových tried,
e = experimentálna frekvencia i-tej triedy,
t = teoretická frekvencia i-tej triedy

Nulová hypotéza link

V tomto štatistickom teste vyslovujeme záver o zhode alebo rozdiele medzi experimentálne získanými a teoreticky očakávanými štiepnymi pomermi na základe testovania nulovej hypotézy. Nulová hypotéza \( (H_0) \) je predpoklad, že neexistuje rozdiel medzi očakávanými a teoretickými výsledkami (\( H_0 = e - t = 0 \)). Na základe výsledkov \( \chi^2 \)–testu nulovú hypotézu:

1. prijímame – rozdiely medzi experimentálnymi a očakávanými hodnotami vznikli len vplyvom náhody, resp. nešťastne zvolenej vzorky
2. zamietame – rozdiely sú štatisticky významné (treba zvoliť inú hypotézu)

Nami zvolená hypotéza musí byť testovateľná. Ako príklad môže slúžiť hod mincou. Ak je hod mincou náhodný a spravodlivý, tak teoreticky polovica hodov bude „hlava” a polovica „znak”. Hypotézu „hody nie sú náhodné” (t.j. uprednostňuje sa určitá hodnota) nemôžeme testovať, pretože existuje nekonečný počet spôsobov ako môžu byť hody neobjektívne. Naopak hypotéza „hody sú náhodné” je testovateľná, pretože vieme, že 50 % teoretických hodov bude „hlava” a 50 % hodov bude „znak” a výsledný pomer bude 1 : 1. To isté platí aj v prípadoch, keď chceme testovať mendelistické štiepne pomery, resp. génové väzby.

Alternatívna hypotéza link

Alternatívna hypotéza \( (H_1) \) je opakom (negáciou) nulovej hypotézy. Alternatívnu hypotézu netestujeme, ale platí automaticky v prípade, že sme nulovú hypotézu zamietli. Protikladom k nulovej hypotéze „gény nie sú vo väzbe” je alternatívna hypotéza „gény sú vo väzbe”.

Stupne voľnosti (DF) link

V tabuľke sa nachádzajú rôzne hodnoty \( \chi^2 \), ktoré sú zoradené do riadkov podľa stupňov voľnosti (\( DF \)) (angl. degrees of freedom). Stupne voľnosti predstavujú počet kategórií zmenšený o 1 (\( n - 1 \)). Je dôležité zdôrazniť, že počet kategórií (\( n \)) závisí od formulácie nulovej hypotézy, nie výhradne od počtu pozorovaných fenotypových tried. Napríklad pri testovaní väzby génov môžeme štyri fenotypy zlúčiť do dvoch kategórií (parentálne a rekombinantné), čím sa \( DF \) mení z 3 na 1.

Pravdepodobnosť (P) link

\( P \)-hodnota vyjadruje pravdepodobnosť, že získame výsledok rovnaký alebo extrémnejší ako ten nameraný, za predpokladu, že nulová hypotéza je pravdivá. Zároveň určuje pravdepodobnosť chyby I. typu – teda riziko, že zamietneme \( H_0 \), hoci je v skutočnosti pravdivá. Napríklad hodnota \( \chi^2 = 3{,}43 \) pre 3 stupne voľnosti sa nachádza medzi \( P = 0{,}20 \) a \( 0{,}50 \). To znamená, že v 20–50 prípadoch zo 100 nezávislých opakovaní experimentu vzniknú nezrovnalosti medzi teoretickými a získanými hodnotami pri nami zvolenej hypotéze LEN v dôsledku náhody.

V prípade, že vypočítaná \( \chi^2 \)-hodnota je nízka (napr. pri \( DF = 3 \) je to 0,5), zamietnutím nulovej hypotézy by sme sa dopustili až 90 % chyby, ak je nulová hypotéza pravdivá. Preto pri takýchto hodnotách \( H_0 \) vždy prijímame.

Hladina významnosti (α) link

Hladina významnosti predstavuje najnižšiu kritickú hranicu pravdepodobnosti, s akou zamietame nulovú hypotézu. Môžeme, ale nemusíme ju stanoviť pred testovaním našej hypotézy (v tom prípade len interpretujeme, aká pravdepodobnosť prislúcha nášmu výsledku \( \chi^2 \)). Ak si za hladinu významnosti zvolíme napr. pravdepodobnosť 20 %, prienikom stupňov voľnosti v riadku s pravdepodobnosťou v stĺpci 0,2 (alebo 20 %) dostaneme \( \chi^2 \)–hodnotu, pri ktorej už nulovú hypotézu zamietame. To znamená, že ak vypočítaná \( \chi^2 \)–hodnota je rovná alebo vyššia ako \( \chi^2 \)–hodnota v tomto prieniku, nulovú hypotézu zamietame, ak je nižšia, nulovú hypotézu prijímame.

Väčšina autorov uvádza hladinu významnosti \( \alpha = 0{,}05 \) ako štatisticky významný a \( \alpha = 0{,}01 \) ako štatisticky vysoko významný vzťah. To znamená, že ak je hladina významnosti \( 0{,}05 \), pozorované odchýlky môžeme považovať za čisto náhodné len v 5 prípadoch zo 100 (v 95 prípadoch budú odchýlky vzniknuté vplyvom iných činiteľov). Takže, keď nám výjde \( \chi^2 \)–hodnota väčšia ako kritická hodnota, znamená to pri \( P = 0{,}05 \) veľmi vysokú pravdepodobnosť, že odchýlka je štatisticky významná. Teda znížením hladiny významnosti zvyšujeme presvedčenie, že pri vyšších \( \chi^2 \)–hodnotách ako je kritická hodnota nezamietneme pravdivú hypotézu.

Testovanie mendelistických štiepnych pomerov link

Pri krížení drozofíl línie N-72 (normálne dlhé krídla, normálna farba tela) s dvojnásobne recesívnou mutantnou líniou hairy brown boli získané tieto fenotypové štiepne pomery: 80 jedincov normálneho fenotypu (h+bw+), 36 jedincov fenotypu hairy (nadpočetné štetinky; hbw+), 42 jedincov fenotypu brown (hnedé oči; h+bw) a 8 jedincov hairy brown (hbw). Zistite, či sa tento experimentálny štiepny pomer štatisticky odlišuje od teoreticky očakávaného štiepneho pomeru \( 9 : 3 : 3 : 1 \) (nulová hypotéza).

Zostrojíme tabuľku, kde vypočítame \( \chi^2 \)–hodnotu, ktorú potom porovnáme s hodnotou v tabuľke pre hladinu významnosti 5 % (0,05):

1. spočítame všetky jedince z experimentu (\( 80 + 36 + 42 + 8 = 166 \)) a ideálne štiepne pomery (\( 9 + 3 + 3 + 1 = 16 \))
2. vypočítame očakávané štiepne pomery vydelením počtu všetkých jedincov so súčtom ideálnych štiepnych pomerov (\( 166 ÷ 16 = 10,37 \Rightarrow 9 \times 10{,}37 = 93{,}37 \Rightarrow 3 \times 10{,}37 = 31{,}12 \))
3. vypočítame rozdiel experimentálnych a teoretických hodnôt pre každú fenotypovú triedu; pozn.: je v podstate jedno, čo od čoho odčítate, pretože v ďalšom kroku sa tento rozdiel umocní, takže výsledkom bude absolútna hodnota
4. umocníme vypočítaný rozdiel a vydelíme ho počtom všetkých jedincov: \( \frac{(e - t)^2}{t} \)
5. sčítame všetky hodnoty v poslednom stĺpci tabuľky a výsledkom je jedna \( \chi^2 \)–hodnota, ktorú porovnáme s tabuľkovou hodnotou
6. počet stupňov voľnosti predstavuje počet tried zmenšený o jednu: \( 4 - 1 = 3 \); prienik v riadku \( DF = 3 \) a hladiny významnosti \( \alpha = 0{,}05 \) v tabuľke \( \chi^2 \)–hodnôt (\( 7{,}82 \)) porovnáme hodnoty

Pretože \(\chi^2_{\text{vypočítaná}} = 7,01\) je menšia ako tabuľková hodnota \(\chi^2_{\text{tabuľková}} = 7,82\), môžeme potvrdiť, že rozdiely sú iba náhodné a nie sú štatisticky významné. Vypočítanej hodnote pri \(DF = 3\) zodpovedá pravdepodobnosť v rozsahu \(0,05 < P < 0,10\). Keďže je táto hodnota vyššia ako zvolená hladina významnosti (\(\alpha = 0,05\)), nulovú hypotézu nezamietame. Experimentálne dáta sú v zhode s očakávaným pomerom.

Týmto spôsobom môžeme testovať akýkoľvek štiepny pomer, vrátane génových interakcií a stanoviť najpravdepodobnejší spôsob dedičnosti daného znaku (znakov).

Testovanie väzby génov link

Pomocou \( \chi^2 \)–testu možno na základe testovacieho kríženia jednoducho zistiť, či gény determinujúce určitý znak sú alebo nie sú vo väzbe, a dokonca v akej fáze (cis alebo trans) sa v prípade väzby nachádzajú vo väzbovej skupine.

Zvolíme si na to rodičov, z ktorých jeden je heterozygotom pre oba znaky (AaBb) a druhý je recesívnym homozygotom (aabb). V tomto prípade sú možné 4 genotypové kategórie, ktoré by sa mali vyskytovať v rovnakom pomere. Na základe mendelistického kríženia by sme mali očakávať, že všetky 4 možné genotypy vzniknú s 25 % pravdepodobnosťou.

Ak by však gény AB (fáza cis) tvorili jednu väzbovú skupinu, preferovalo by to u heterozygotného rodiča výskyt gamét AB a ab na úkor rekombinantných aB a Ab, čo by sa prejavilo aj v vyššom počte potomkov nesúcich takúto kombináciu génov. Ak by však naopak bolo viac potomkov s kombináciou aB alebo Ab, znamenalo by to, že gény vo väzbovej skupine heterozygotného rodiča sú vo fáze trans.

Ešte jednoduchšie je si celú situáciu predstaviť v prípade, ak sú alely vo vzťahu úplnej dominancie. Ak sú gény vo väzbe, počet jedincov s rodičovským fenotypom (A+B+, aabb) sa bude odlišovať od rekombinantov (A+bb, aaB+). Z hľadiska toho, či existuje alebo neexistuje medzi dvomi génmi väzba, nás preto zaujímajú len uvedené 2 fenotypové triedy: parentálne a rekombinantné fenotypy.

Ak sú gény voľne kombinovateľné, výskyt parentálnych a rekombinantných fenotypov bude v pomere \( 1 : 1 \). Ak sú gény vo väzbe, u potomstva bude preferovaný výskyt buď jedného alebo druhého fenotypu. S tým súvisí aj princíp, ako zostaviť vhodnú testovateľnú nulovú hypotézu. Ak sú gény vo väzbe, nepoznáme teoretický fenotypový štiepny pomer. Ten je známy len vtedy, ak predpokladáme, že gény nie sú vo väzbe, pretože vtedy na základe voľnej kombinovateľnosti génov A a B získame spomenuté fenotypové kategórie v pomere \( 1 : 1 \). Vždy teda testujeme nulovú hypotézu „gény nie sú väzbe”.

Alela b v recesívne homozygotnom stave vedie k čiernemu zafarbeniu tela drozofíl (black) a recesívny homozygot v alele vg má zakrpatené krídla (vestigial). Po krížení heterozygota a recesívneho homozygota v oboch génoch sme získali nasledovné počty jedincov: 283 jedincov normálneho fenotypu (b+vg+), 1294 jedincov so zakrpatenými krídlami (b+vg), 1418 jedincov s čiernou farbou tela (bvg+) a 241 jedincov s čiernym telom a zakrpatenými krídlami (bvg). Na základe výsledkov z uvedeného testovacieho kríženia zistite, či sú tieto dva gény vo väzbe.

Postup k výpočtu \( \chi^2 \)–hodnoty je uvedený v predchádzajúcom príklade pri testovaní mendelistických štiepnych pomerov. Keďže sme v podstate testovali, či je pomer rekombinantov a rodičovských fenotypov \( 1 : 1 \) (a v takom prípade by sa jednalo o voľnú kombinovateľnosť), existuje len 1 stupeň voľnosti (\( 2 – 1 = 1 \)). Na základe počtov jedincov v jednotlivých fenotypových triedach je zrejmé, že pôvodný heterozygotný rodič má gény vo väzbe vo fáze trans.

Keďže vypočítaná hodnota \( \chi^2 \) je omnoho vyššia ako hodnota \( \chi^2 \), ktorá je v prieniku \( DF = 1 \) a \( \alpha = 0{,}05 \) (alebo trebárs aj \( 0{,}001 \)), značí to, že v menej ako 1 prípade z 1000 vzniknú odchýlky od očakávaných štiepnych pomerov LEN v dôsledku náhody. Znamená to, že vzniknuté odchýlky sú štatisticky natoľko významné, že nulovú hypotézu musíme zamietnuť. Zamietnutím hypotézy gény nie sú vo väzbe je jedinou logickou alternatívou, že gény sú vo väzbe. Odchýlky od očakávaných štiepnych pomerov tak vznikli v experimente v dôsledku toho, že gény sú vo väzbe a nevzniká ekvivalentný počet rodičovských a rekombinantných fenotypov.

Extrémne vysoká vypočítaná hodnota \(\chi^2 = 1479,4\) pri \(DF = 1\) znamená, že \(P < 0,001\). Pravdepodobnosť, že by takéto výrazné odchýlky od očakávaných pomerov vznikli len v dôsledku náhody, je teda zanedbateľná (menej ako 0,1 %). Vzniknuté rozdiely sú štatisticky vysoko významné, preto nulovú hypotézu o voľnej kombinovateľnosti zamietame. Jedinou logickou alternatívou zostáva, že sledované gény sú vo väzbe.